Замай мемы: Кто такой Замай — самый ненавидимый русский рэпер прямо сейчас

Mateja Vidic

¹ Кафедра генетической токсикологии и биологии рака, Национальный институт биологии, Любляна, Словения

² Jožef Stefan International Postgraduate School, Словения,, Словения,, Словения,

³ Центр передового опыта в области биосенсоров, контрольно-измерительной аппаратуры и управления процессами, Центр биотехнологии, Айдовщина, Словения

Ника Янез

³ Центр передового опыта в области биосенсоров, приборов и управления процессами, Центр биотехнологий, Словения

Michael Blank

⁴ AptaIT GmbH, Мюнхен, Германия

Tomaz Accetto

⁵ Департамент зоотехники, Bi технический факультет, Университет Любляны, Любляна, Словения

Ян Маври

³ Центр передового опыта в области биосенсоров, приборов и управления процессами, Центр биотехнологии, Айдовщина, Словения

Isis C.Nascimento

⁶ Отделение биохимии, Институт химии, Университет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия

Артур А. Нери

⁶ Отделение биохимии, Институт химии, Университет Сан-Паулу, Сан-Паулу Бразилия

Проф. Хеннинг Ульрих

⁶ Отделение биохимии, Институт химии, Университет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия

Проф. Тамара Т. Ла

¹ Отдел генетической токсикологии и биологии рака, Национальный институт биологии, Любляна, Словения

⁷ Кафедра биохимии, факультет химии и химической технологии, Университет Любляны, Любляна, Словения

¹ Кафедра генетической токсикологии и биологии рака, Национальный институт биологии Любляны , Словения

² Международная школа последипломного образования им. Йожефа Стефана, Любляна, Словения

9067 8 3 Центр передового опыта в области биосенсоров, контрольно-измерительной аппаратуры и управления процессами, Центр биотехнологии, Айдовщина, Словения

⁴ AptaIT GmbH, Мюнхен, Германия

⁵ Кафедра наук о животных, Биотехнический факультет, Университет Любляны, Любляна, , Словения

⁶ Кафедра биохимии, Институт химии, Университет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия

⁷ Кафедра биохимии, Факультет химии и химической технологии, Университет Любляны, Любляна, ^* Проф.Хеннинг Ульрих, Департамент биохимии, Институт химии, Университет Сан-Паулу, Av. Проф. Линеу Престес 748, Сан-Паулу, 05508-000 SP, Бразилия. rb.psu.qi@gninneh

^* Профессор Тамара Т. Ла, Национальный институт биологии, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, Slovenia

* Текущий адрес: Aptamer Group, York YO10 5NY, United Kingdom

** Фактический адрес: Компания Lek-Sandoz, Любляна, Словения

Поступила в редакцию 24 ноября 2017 г .; Принято 26 февраля 2018 г.

. Эта работа находится под лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 3.0 License.

Abstract

Предпосылки

Обнаружение циркулирующих раковых клеток легкого с характеристиками, подобными раковым стволам, представляет собой улучшенный инструмент для прогноза заболевания. Однако современные методы на основе антител имеют некоторые недостатки, и поэтому клеточный SELEX (систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения) был использован для разработки ДНК-аптамеров, распознающих маркеры клеточной поверхности немелкоклеточной карциномы легкого (NSLC).

Материалы и методы

Клеточную линию аденокарциномы человека A549 использовали для отбора в семи клеточных циклах SELEX. Мы использовали лейкоциты крови человека для отрицательной селекции и антитело, связывающее антитело CD90, маркер стволовых клеток легких, клетки A549 для положительной селекции.

Результаты

Полученные олигонуклеотидные последовательности после седьмого цикла SELEX были подвергнуты селекционному анализу in silico , основанному на трех независимых типах биоинформатических подходов, выбрав двух близкородственных кандидатов в аптамеры с точки зрения консенсусных последовательностей, структурных мотивов, аффинности связывания ( Kd) и устойчивости (ΔG).Мы выбрали и идентифицировали аптамер A155_18 с очень хорошими характеристиками связывания с клетками A459, отобранными для связывания антитела CD90. Рассчитанное филогенетическое дерево показало, что аптамеры A155_18 и известный аптамер S6 клеток A549 имеют тесное структурное родство. Анализ последовательности цМема показал, что они имеют два уникальных мотива, отсутствующих в других последовательностях.

Выводы

Новый аптамер A155_18 имеет сильную аффинность связывания с субпопуляцией линии клеток карциномы легкого A549, которая экспрессирует маркер стволовых клеток CD90, что указывает на возможную стволовость, характерную для линии A459, или субпопуляцию, присутствующую в этой клеточной линии.Этот аптамер можно применять в качестве диагностического инструмента для идентификации циркулирующих клеток NSLC.

Ключевые слова: аптамеров, клеточный SELEX, циркулирующие опухолевые клетки, немелкий рак легкого, вычислительная биология

Введение

ДНК-аптамеры приобретают третичные структуры олигонуклеотидов, которые позволяют им связываться с различными целевыми макромолекулами, такими как белки через нековалентное связывание. Аффинность связывания аптамера с эпитопами клеточной поверхности находится в диапазоне моноклональных антител. ^{1 , 2} Предполагается, что аптамеры, предназначенные для связывания со всей клеткой, связываются либо со специфическими белками, либо с другими сложными молекулярными структурами. Аптамеры с сильным связыванием отбираются с помощью метода отбора in vitro, в пошаговом процессе из начальной комбинаторной библиотеки из 10 ¹⁵ случайных олигонуклеотидов с помощью процесса, называемого SELEX (Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения), обзор Шмука и Ульриха . ³ Вкратце, процесс SELEX включает пять основных этапов: связывание, разделение, элюирование, амплификация и кондиционирование повторяющимся и поэтапным способом, который сужается до гомогенной популяции последовательностей с высокой целевой аффинностью и селективностью. ⁴ Используемый здесь подход Cell-SELEX является модификацией оригинала исходного метода, в котором отбор аптамеров связывается с эпитопами клеточной поверхности клеток-мишеней, т.е. е. опухолевых клеток, следует этап отрицательной селекции против нецелевых клеток для удаления любых последовательностей, которые обычно связываются с эпитопами, экспрессируемыми обоими типами клеток. Окончательно полученные аптамеры должны быть селективными для желаемого типа клеток. ^{5 , 6}

Хотя основные механизмы связывания мишени аптамера известны, теоретическое предсказание связывания отдельных олигонуклеотидов с клеточными поверхностями невозможно.Однако недавно были разработаны новые инструменты биоинформатики, которые могут различать уже выбранный набор аптамеров с самой низкой константой диссоциации и самой высокой энергией связи. При раке аптамеры были предложены для замены антител в основном в диагностических целях, поскольку они более надежны с точки зрения воспроизводимости, стабильности и стоимости производства ⁷ .

Обнаружение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в биологических жидкостях до или во время первого медицинского вмешательства представляет собой особую проблему для прогнозирования прогрессирования заболевания ⁸ .Две технологии, используемые для подсчета ЦКО, система поиска клеток ^® , основанная на обнаружении маркеров белков мембран раковых клеток с помощью антител ⁹ , и платформа ISET (изоляция клеток эпителиальной опухоли по размеру), основанная на исключении размера клеток, сами по себе и не используются в качестве дополнительных компонентов для диагностики на основе ЦОК ⁹ , поэтому необходимы новые подходы. Заболеваемость раком легких и уровень смертности продолжают расти. Подгруппа НМРЛ, по-видимому, имеет самые высокие показатели заболеваемости и в большинстве случаев является местнораспространенной или метастатической на момент постановки диагноза. ¹⁰ Таким образом, мы использовали клеточную линию A549, полученную из первичной опухоли пациента с НМРЛ, для повышения уровня аптамеров. К настоящему времени было предпринято несколько успешных попыток воздействовать на клетки NSCL в кровотоке (ЦОК легких) с помощью специфических аптамеров. ^{11 , 12 , 13} Однако они не касались потенциальной стволовости ЦКО, которая, по-видимому, способствовала различению клеток с самым высоким канцерогенным потенциалом и, таким образом, более актуальна для агрессивного прогрессирования и худшего прогноза рак легких.Эти стволовые клетки рака легких (CSC) экспрессируют высокие уровни белка CD44 ^high и CD90 ⁺ . ¹⁴ Кроме того, было показано, что клетки CD90 ⁺ A549 также экспрессируют маркеры CSC, такие как Oct4, Sox2 и некоторые другие. ¹⁴ Эти клетки имели более высокую скорость пролиферации и онкогенную способность, и Yan et al . предположили, что среди пациентов с раком легких существует субпопуляция клеток CSC легких, которые могут быть обнаружены с помощью специфических аптамеров.Таким образом, целью этого исследования была разработка ДНК-аптамеров, которые также связывали бы биомаркеры раковой стволовой поверхности клеток и были бы подходящими для обнаружения подобных стволовых клетках ЦОК в кровообращении. Новизной в этом исследовании является более эффективная разработка связывания аптамера с поверхностью клетки-мишени, основанная также на отборе in silico с помощью новых инструментов биоинформатики, используемых впервые, и предлагает их применение в будущих идентификациях аптамеров.

Материалы и методы

Культура клеток и реагенты

Клеточная линия карциномы легких человека A549 (ATCC® CCL-185 ™, ATCC, Manassas, VA) при пассаже 60 культивировалась в среде DMEM (Millipore Sigma, Burlington, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пока они не достигнут примерно 80% слияния.Клетки промывали для удаления остатков среды, а затем отделяли от бутылок с 2 мМ раствором EDTA (Millipore Sigma, Burlington, MA). Аутентификация клеточной линии была выполнена с использованием протокола аллеля IdentiCell STR и показала 100% совпадение с клетками A549 (IdentiCell, Департамент молекулярной медицины, Орхус, Дания).

Дизайн библиотеки Cell-SELEX

Случайная библиотека (5′-FITC-GCC TGT TGT GAG CCT CCT-N34-CGC TTA TTC TTG TCT CCC-3 ‘), содержащая 34 случайных основания, фланкированных константными областями для связывания праймеров во время реакции ПЦР-амплификации. ¹⁵ Прямой праймер представлял собой 5′-BBB-GCC TGT TGT GAG CCT CCT-3 ‘, где BBB указывает на 3 последующие части биотина, в то время как обратный праймер был помечен 6-FAM или изотиоцианатом флуоресцеина (FITC-5’- GGG AGA CAA GAA TAA GCG-3 ‘). Перед первым циклом отбора библиотеку амплифицировали с помощью реакции ПЦР (условия ПЦР, описанные в дополнительном материале), подвергали денатурации, и флуоресцентную одноцепочечную ДНК очищали денатурационным ПААГ. В начале цикла SELEX пул аптамеров в буфере для отбора денатурировали при 95 ° C в течение 10 минут, а затем сразу помещали на лед на 10 минут с последующей 20-минутной инкубацией при комнатной температуре.

Отбор аптамеров

После инкубации клеток с аптамерами применяли методику BRAZIL с центрифугированием смеси клеток и олигонуклеотидов через смесь дибутилфталат: циклогексан (9: 1 [об: об]; d = 1,03 г .ml-1) слой ¹⁶ .

Вкратце, клетки со связанными аптамерами собирали из осадка органической фазы и разделяли центрифугированием (13000 g в течение 10 мин (центрифуга Hettich Universal 32R, HETTICH Instruments LP, Беверли, Массачусетс).Осадок, содержащий аптамеры, экстрагировали фенолом / хлороформом (1: 1) для очистки полученной ДНК с последующей ПЦР, как подробно описано выше, и разделением цепей для следующего цикла SELEX. Чтобы выполнить отбор лигандов с более высоким сродством, строгость отбора постепенно увеличивалась в каждом цикле путем добавления 0,3 — 3 мг / мл тРНК для снижения неспецифического связывания и увеличения соотношения молекул ДНК по клеткам (10 ⁶ -10 ⁵ ячеек).

В седьмом цикле был проведен первый отрицательный отбор с клетками крови человека (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты в количестве 10 ⁷ клеток), за которым последовал этап положительного отбора против 10 ⁵ клеток A549.Клетки крови отделяли от плазмы путем разделения в градиенте плотности. ¹⁷ Стадия отбора против клеток CD90 ⁺ A549 была проведена после очистки с сортировкой клеток этой субпопуляции.

Анализ проточной цитометрии связывания аптамера с клетками A549

Эти анализы проводили с живыми клетками A549, которые не обрабатывались фиксирующими агентами согласно Nascimento et al . (2016). ¹⁸ Пулы инкубировали в связывающем буфере (1.25 мМ HEPES, 0,27 мМ KCl, 0,14 мМ CaCl ( ₂ , 0,06 мМ MgCl2, 7,19 мМ NaCl, 0,9% глюкоза) в течение 10 минут при 95 ° C, а затем сразу же помещают на лед на 10 минут и выдерживают в течение 20 минут при комнатной температуре. . Для взаимодействия между одноцепочечными молекулами ДНК и клетками раствор, содержащий аптамеры, осторожно смешивали с клетками (10 ⁶ клеток / микропробирку) до конечного объема 100 мкл и концентрации аптамеров 200 пМ. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре при осторожном встряхивании.Смесь центрифугировали при 200 × g и супернатант отбрасывали. Промывали связывающим буфером, смесь снова центрифугировали и супернатант отбрасывали. Затем добавляли 500 мкл связывающего буфера с последующим анализом проточной цитометрии. Для анализа клеток с двойной меткой антитело против CD90 (1: 1000) добавляли к клеткам вместе с пулами олигонуклеотидов. Для сортировки клеток применяли ту же процедуру и определяли ворота для сбора клеток с двойной меткой для экспрессии CD90 и олигонуклеотидов аптамера.

Пул седьмого цикла содержал аптамеры с усиленным связыванием с субпопуляцией клеток A549, экспрессирующих CD90, что было обнаружено по усиленным сигналам флуоресценции. Поскольку идентифицированная субпопуляция продемонстрировала характеристики стволовых клеток ¹³ , сортировку клеток использовали для выделения идентифицированной фракции клеток. Была успешно собрана фракция из 2500 клеток, и аптамеры были очищены для амплификации ПЦР (данные не показаны).

Секвенирование

Аптамеры селекционного пула, полученные в каждом цикле, тестировали с помощью рестрикционного анализа (RFLP — Restriction Fragment Length Polymorphism) на наличие консервативных сайтов рестрикции.Были получены различные полосы, представляющие фрагменты ДНК с консервативными сайтами рестрикции, что свидетельствует о селективном обогащении определенных групп олигонуклеотидов во время SELEX (приложение).

Проточная цитометрия клеток, дважды меченных CD90 и аптамерами. (A) Проточную цитометрию проводили для FITC-меченых пулов аптамеров, сравнивая связывание со связыванием клеток A549 пула библиотеки), шестой цикл и пул после цикла отрицательной селекции против клеток крови. Графики плотности показывают, что не было разницы в процентном содержании меченых клеток для каждого из пулов.Наблюдалось смещение популяции на графике плотности и сдвиг положения на гистограммах для клеток, помеченных пулом, которые следовали за отрицательной селекцией против клеток крови, показывая популяцию клеток с повышенной интенсивностью флуоресценции по сравнению с клетками, помеченными как исходная библиотека или пул из 6 циклов ^-го . (B) Связывание CD90 и сортировка клеток: после регулировки клеточных ворот для немеченых клеток, CD90 +, библиотеки и пула после отрицательного отбора, клетки с двойной меткой, меченные для CD90 / библиотеки и CD90 / пула отрицательной селекции, были в сравнении.Здесь ворота были настроены для сбора наиболее сильно меченых клеток с пулом аптамеров после отрицательного отбора. Чтобы подтвердить профиль изолированной популяции, отсортированные клетки снова анализировали с помощью проточной цитометрии (пост-сортировка). Графики плотности показывают присутствие четко определенной вторичной популяции, которая была дважды помечена, что позволяет предположить, что аптамеры распознавали субпопуляцию CD90, которая была положительной для стволовых клеток в популяции клеток A549.

Последовательности из последних трех циклов были использованы для секвенирования по Сэнгеру и следующему поколению (дополнительный материал).Выбранные последовательности были дополнительно проанализированы с использованием различных биоинформатических подходов.

Биоинформатический анализ

Для обработки выбранных последовательностей использовались три различных процедуры отбора in silico : программное обеспечение CLC Genomics Workbench, сценарий Shell в сочетании с конвейерными программами использования для обработки нуклеотидных последовательностей — MEME ¹⁹ , MEGA6 ²⁰ и UnaFold ²¹ и программное обеспечение COMPAS (AptalT GbmH, Planneg, Германия). ²²

Мы сравнили молекулярные эволюционные отношения (с программой MEGA6 ²⁰ ) и сходство мотивов (с набором MEME ¹⁹ ) выбранных четырех лучших кандидатов связывания (A155_18, A452_3, A373_4, A218_12) и уже опубликованного аптамера S6. связывание с клетками A549 (5′-GTG GCC AGT CAC TCA ATT GGG TGT AGG GGT GGG GAT TGT GGG TTG-3 ‘). ¹¹

Проверка выбранных кандидатов

Приготовление аптамеров

Аптамеры растворяли до конечной концентрации 0,5 мкМ в связывающем буфере, содержащем 25 мМ HEPES (Millipore Sigma) 5,4 мМ KCl, 2,8 мМ CaCl _{2 909 3,2 мМ MgCl 2 и 144 мМ NaCl в ddH 2 O, денатурировали при 95 ° C и ренатурировали при комнатной температуре, каждый по 20 мин. Далее клетки инкубировали в течение 20 мин при 25 ° C с 0,5 мкМ раствора аптамера, меченного 6-карбоксифлуоресцеином (6-FAM), в 200 мкл буфера для связывания при осторожном перемешивании.Затем клетки дважды промывали буфером для связывания перед анализом связывания клеткой A459 с аптамером проточной цитометрией. Для определения неспецифического связывания мы использовали олигонуклеотид 6’-FAM со случайной областью из 34 нуклеотидов. Чтобы определить, будет ли связывание между аптамером и клетками-мишенями зависеть от температуры, анализы связывания также проводили при 4 ° C и 37 ° C.}

Связывание антитела CD90 с клетками A549

Для определения экспрессии белка CD90 в клетках A549 их инкубировали с антителом против CD90 / Thy1 (PE / Cy5) (ab95698) и для анализов отрицательного контроля с изотипическим контролем мышиного IgG1, каппа моноклональный (PE / Cy5) (ab67435), полученный от AbCam (Кембридж, Великобритания).Клетки отделяли 0,02% EDTA и фильтровали через сито 70 мкм, чтобы избежать дублетов. Клетки — 300 000 на анализ трижды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубировали в течение 30 минут при 4 ° C, а затем ресуспендировали в 500 мкл ледяного PBS перед анализом проточной цитометрии.

Подготовка клеток крови для отрицательного контроля

Поскольку целью разработки аптамеров было обнаружение клеток NSCL в крови в виде ЦОК, клетки крови были выделены от здорового донора (мужчина, 40 лет), лизированного буфером, содержащим 150 мМ NH ₄ Cl, 10 мМ NaHCO ₃ и 0.1 мМ ЭДТА и центрифугировали при 300 × g в течение 5 мин при комнатной температуре. Клетки крови ресуспендировали в связывающем буфере и использовали в качестве мишени для связывания на этапе отрицательной селекции с предварительно элюированной ДНК пула SELEX для разделения аптамеров, обладающих сродством к мишени опухолевых клеток, и для отбрасывания последовательностей, также связывающихся с контрольными клетками крови. Остальные последовательности, специфичные для клеток-мишеней, были дополнительно амплифицированы с помощью ПЦР, чтобы сформировать исходный пул для последнего раунда положительного отбора.

Проточная цитометрия

Мы измерили 30 000 событий на образец, используя прибор проточной цитометрии MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия) или проточный цитометр Attune (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс). Для установки ворот мы использовали немаркированные ячейки A459.

Для определения констант равновесной диссоциации (K _d ) связывания аптамера с клетками A549 рассчитывались средние выбросы флуоресценции для каждой из семи различных концентраций (50, 100, 300, 500, 800, 1000 и 1200 нМ). Константы диссоциации рассчитывали с использованием неконкурентного связывания с одним сайтом; Регрессию нелинейной кривой выполняли с использованием GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния).Сортировку клеток выполняли на оборудовании FACSAria I / II (Becton & Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Результаты

Приготовление пула аптамеров для линии клеток A549 с помощью Cell-SELEX

Здесь мы стремились разработать аптамерные зонды, нацеленные на циркулирующие опухолевые клетки NSCLC, благодаря их потенциальной диагностической, прогностической и прогностической способности. Для разработки аптамеров, специфичных для NSCLC, мы выбрали наиболее часто используемые клетки аденокарциномы легкого человека A549 в качестве мишени для клеточного SELEX.Клетки крови человека были приняты в качестве отрицательного контроля для клеточного SELEX для повышения селективности генерируемых аптамеров к клеткам A459.

В процессе отбора культивированные клетки A549 сначала инкубировали с библиотекой синтетической одноцепочечной ДНК из 70 оснований. Последовательности ДНК, которые связывались с клетками A549, затем элюировали и разделяли с помощью метода BRAZIL, как описано в разделе «Материалы и методы».

Мы сравнили пулы аптамеров из исходной библиотеки, шестого цикла и отрицательной селекции.Что касается процентного содержания меченых клеток для каждого пула, существенной разницы не наблюдалось. Мы наблюдали, что популяция клеток, которые были положительны для пула аптамеров от отрицательного отбора, имела более высокую флуоресценцию, как показано сдвигом вправо на графике плотности и перекрытием гистограмм (). Кроме того, мы выполнили проточную цитометрию с использованием антител для обнаружения CD90 в клетках A549 и наблюдали четко определенную популяцию, которая была положительной по CD90 и аптамерам (). Эту популяцию клеток отсортировывали, связанные аптамеры элюировали и амплифицировали с помощью ПЦР.сообщает об увеличении мечения клеток шестого пула отбора после отрицательного отбора против клеток крови.

Полученный пул аптамеров после отрицательной селекции против клеток крови и сортировки аптамеров, связывающихся с субпопуляцией CD90 ⁺ , использовали для дальнейшего секвенирования с целью идентификации кандидатов в аптамеры с консервативными структурными мотивами.

Биоинформатический анализ

Секвенирование пула седьмого цикла с помощью технологии секвенирования следующего поколения Ion Torrent PGM привело к 239 713 считываний, из которых 151 814 считываний были уникальными. In silico Выбор аптамеров из данных NGS был выполнен с использованием трех различных процедур, как описано в дополнительном материале (таблица S1).

Используя программное обеспечение CLC Genomics Workbench, начальный пул из 239 713 считываний был сужен до 16 репрезентативных последовательностей, имеющих наибольшее количество членов последовательности, в диапазоне от 1 080 до 142 копий на репрезентативную последовательность. Их подвергали дальнейшей селекции на основании наличия консервативных мотивов последовательности.Аптамеры A786_1, A574_ 2, A278_8 были отобраны для проверки in vitro , каждый из которых несет уникальный мотив.

Во втором выборе аптамера in silico с использованием доступных онлайн программ обработки нуклеотидных последовательностей сначала отфильтровывали считывания, имеющие неоднозначные основания или неправильную последовательность библиотечных праймеров или ее отсутствие. В оставшемся наборе высококачественных последовательностей 80312 считываний были уникальными, и 81,7% считываний появлялись в наборе только один раз (без копий). Двадцать последовательностей с наибольшим числом копий (прочтений), от 786 до 138 копий, были ранжированы в отношении стабильности вычисленного сворачивания с использованием ΔG (ккал / моль) в качестве меры стабильности и стабильности предполагаемой петли в три самых стабильных вычисленных сворачивания по данным инструмента UnaFold.Аптамеры A155_18, A452_3, A373_4, A218_12 были выбраны для проверки in vitro .

В третьей процедуре выбора in silico , которая была выполнена с использованием программного обеспечения COMPASS, считывания сначала были сгруппированы в 998 семейств с определяющими шаблонами в области пространства петель. Каждая семья была представлена ​​последовательностью (одна с наибольшим количеством повторений), и мы выбрали 21 наиболее частую из них для дальнейшего анализа. Группировка семей в соответствующие кланы зависела от сходства пространств петель — 12 из 21 наиболее часто встречающейся семьи располагались в 10 различных семейных кланах.Дополнительную оценку стабильности структуры применяли с точки зрения температуры плавления в дополнение к ранжированию структуры и аналогично второй процедуре отбора последовательности аптамеров, A155_18 и A452_3 снова были выбраны в качестве лучших кандидатов для связывания.

Отобранные кандидаты в аптамеры дополнительно сравнивали с аптамером S6. Построенная дендрограмма (дополнительный материал,) показывает кластеры кандидатов последовательности аптамера, где аптамер A155_18 и положительный контроль S6 сгруппированы вместе.Среди выбранных кандидатов в аптамер, A155_18 и S6 также являются единственными двумя, имеющими два одинаковых мотива: GGTGG / CG и GCCAGT; согласно предсказанной UnaFold вторичной структуре, мотивы помещаются в сопоставимые структурные последовательности между петлями (дополнительный материал). Возможность перекрестного заражения была исключена, поскольку седьмой пул SELEX был секвенирован перед приобретением положительного контроля S6.

Отобранные и помеченные флуоресценцией четыре кандидата, A155_18, A452_3, A373_4, A218_12, вместе с известным связующим S6 и отрицательной контрольной последовательностью (последовательность с неизвестной случайной областью с длиной 34 нуклеотидов и фланкированы известными праймерами) были использованы в тесте связывания in vitro для определения характеристик связывания.Связывание с клетками A549 было продемонстрировано с помощью анализа проточной цитометрии. Все четыре выбранных аптамера () продемонстрировали повышенное связывание с клеточной линией-мишенью по сравнению с невыбранным контролем (CTRL_N34.012) в соответствии с процентным содержанием флуоресцентно меченых клеток, измеренным с помощью проточной цитометрии. Значения Kd всех четырех выбранных аптамеров находятся в наномолярном диапазоне ().

Предсказанные вторичные структуры четырех кандидатов в аптамеры, выбранные для экспериментов in vitro . Вторичные структуры последовательностей позволяли формировать комплементарную обертку вокруг своей мишени.Непарные основания были ответственны за события связывания, когда парные основания Уотсона-Крика обеспечивали стабильность аптамера. Прогнозируемые вторичные структуры были рассчитаны с помощью UnaFold, представленные — это структуры с наименьшим ΔG, т.е. наивысшей стабильностью (энергетические правила: ДНК, температура 24 ° C, 14,4 мМ NaCl, 3,2 мМ MgCl). Константы равновесной диссоциации Kd (нМ) рассчитывали с использованием GraphPad Prism 5 в рамках модели нелинейной подгонки, отношения неконкурентного связывания на одном сайте к флуоресцентной популяции при использованных концентрациях аптамера.Дополнительные сведения см. В дополнительных материалах.

По сравнению с контрольным случайным аптамером, самые высокие скорости специфического связывания 26% с клетками A549 были получены с A155_18. Гибкое связывание аптамеров при различных температурах может расширить спектр их применения. Поскольку отбор проводили при комнатной температуре (25 ° C), мы проводили анализы связывания также при 4 ° C и 37 ° C. Не наблюдалось разницы в связывании аптамера A155_18 (данные не показаны). Это особенно важно, поскольку клиническое применение аптамеров будет осуществляться в физиологических условиях.

Во время селекции клеток аптамеры специфически взаимодействуют с внешними мембранами плазматических клеток клеток-мишеней. В нашей селекции клеток-SELEX линия клеток-мишеней A549 была обогащена экспрессией маркера стволовости, мембраносвязанного белка CD90. Эту субпопуляцию отбирали методом проточной сортировки против CD90 в популяции клеток A549. Последнее указывает на способность аптамера распознавать CD90-положительные клетки, которые могут быть частью циркулирующих клеток, инициирующих опухоль.

Обсуждение

Лечение рака основано на суррогатных маркерах, отражающих прогрессирование опухоли и, после медицинского вмешательства, также ответ на терапию.Другая проблема, которая препятствует разработке новых терапевтических подходов для пациентов с раком легкого, связана с отбором репрезентативных образцов опухоли (легкого). ^{22 , 23 , 24} Циркулирующие опухолевые клетки (ЦКО) являются многообещающими, поскольку они обеспечивают легкодоступный жидкий образец биопсии для обнаружения микрометастазов в реальном времени. Помимо их перечисления и характеристики, анализ ЦОК предлагает возможность механистических исследований прогрессирования злокачественного рака ⁷ .Только недавно было обнаружено, что раковые стволовые клетки (CSC), находящиеся в периартериолярных нишах, претерпевают эпителиально-мезенхимальный переход и оттуда проникают в базальную мембрану сосудов, попадая в кровоток и превращаясь в CTC. Кроме того, накоплено большое количество доказательств пластичности РСК и внутриопухолевой гетерогенности, в основном из-за наличия РСК различных подтипов и степеней дифференцировки. Таким образом, было бы практически невозможно нацелить все эти субклоны одним событием.Таким образом, аптамеры, которые мы разработали здесь в качестве биомаркеров ЦОК NSCLC, будут распознавать по крайней мере один маркер стволовых клеток NSLC, и нам удалось разработать аптамер, распознающий субпопуляцию A459 NSCLC, экспрессирующую маркер CSC CD90 / Thy-1 ¹³ . Действительно, после последнего цикла SELEX и сортировки на CD90-положительные клетки мы показали, что около 30% клеток являются положительными по этому маркеру среди популяции клеток A549.

Все предыдущие аптамеры, разработанные для нацеливания на НМРЛ, были отобраны на основе процедуры клеточного SELEX, начиная с библиотеки одноцепочечной ДНК и продолжая 25, 18 и 11 раундов по Zhao et al ., Хименес и др. . и Zamay и др. . ^{10 , 11 , 12} соответственно. Все отобранные аптамеры связываются со своими мишенями в наномолярном диапазоне Kd. Последовательности, выбранные Zhao et al . ¹⁰ , аптамеры S1, S6, S11e и S15, все обладали способностью связываться с клетками A549 и дифференцировать нормальные клетки легких и клетки карциномы. После предварительной обработки клеток-мишеней трипсином связывание выбранного аптамера исчезло, что убедительно указывает на то, что молекулы-мишени этих аптамеров были или были прочно связаны с мембранными белками; однако мы не анализировали их дальше.Мишень для отбора использовали Jimenez et al . ¹¹ был клеточной линией аденокарциномы h33, хотя их лучшие связывающие вещества (аптамеры EJ4 и ADE1) также показали хороший потенциал связывания с клеточной линией A549. Однако они не были селективными по отношению к раку легких, поскольку они также распознали клеточную линию аденокарциномы толстой кишки TOV21G. В качестве возможной причины для этого эти аптамеры распознали более общий маркер клеточной поверхности карциномы человека, все тестируемые клеточные линии имели эпителиальное происхождение.Замай и др. . ¹² отобранных ДНК-аптамеров для клеток аденокарциномы легких, полученных из послеоперационных тканей без предварительного знания белковых биомаркеров, заявив, что аптамеры, специфичные к поверхностному белку культивируемых клеток, могут не связываться с опухолевыми клетками в клинических образцах из-за разницы в экспрессии белка между культивируемые и первичные опухолевые клетки. Для Cell-SELEX эти авторы использовали образцы послеоперационной ткани и показали, что выбранные аптамеры не связываются со здоровыми клетками легких и клеточной линией аденокарциномы легкого A549.После успешного отбора они определили восемь биомаркеров-кандидатов, связанных с четырьмя отобранными аптаперами.

Мы выбрали опубликованный аптамер S6, специфичный для связывания клеток A549 с низким значением Kd, в качестве положительного контроля связывания ¹¹ , имеющий высокую селективность в отношении NSCLC без потенциала связывания с SCLC и клетками плоскоклеточной карциномы. Его структура аналогична выбранному нами аптамеру, с 45 нуклеотидами в случайной области, фланкированной константными областями длиной 20 нуклеотидов на обоих сайтах.Как и ожидалось, аптамер S6 показал хороший потенциал связывания с клетками A549 также при использовании нашего протокола. Аптамер S6 был выбран после 25 раундов, тогда как в нашей процедуре SELEX потребовалось только семь раундов. Поэтому мы улучшили процесс отбора, сократив количество раундов отбора, используя подход биоинформатики. Аптамер S6 использовали в качестве контроля не только в отношении нуклеотидной последовательности, но и присутствующих структурных мотивов, поскольку они имеют решающее значение для связывания с выбранной клеткой-мишенью.

Отбор аптамеров in silico был проведен после седьмого цикла SELEX, включая отрицательный отбор против клеток крови, и дал удовлетворительное качество считывания секвенирования. Мы смогли отфильтровать несколько высококачественных считываний с использованием различных фильтров, от длины до базового состава (неоднозначные базы и библиотечные праймеры). Мы ожидали высокой вариабельности уникальных последовательностей, поскольку на клетках A459 имеется множество различных эпитопов (белков, гликопротеинов и т. Д.), Которые потенциально могут быть распознаны аптамерами.Низкое количество копий наиболее частых считываний было неожиданным, так как, например, при разработке другой клетки — SELEX, используя сложные бактериальные споры в качестве мишеней SELEX, мы получили в 10 раз больше копий (COBIK, неопубликованный). Основываясь на критериях, используемых для выбора кандидатов в аптамер, мы предполагаем, что физико-химические свойства вычисленного фолдинга (ΔG, Tm, состав оснований в петле) являются подходящим критерием для оценки олигонуклеотидов, полученных всего за несколько раундов SELEX.

В заключение мы выбрали аптамер A155_18, связывающийся с субпопуляцией линии клеток аденокарциномы легкого A549, экспрессирующий маркеры стволовости, такие как CD90.Эта последовательность аптамера с двумя очень похожими мотивами, указывающими на перекрывающуюся активность с положительным контролем (аптамер S6), обеспечивает доказательство принципа новых подходов. Методологически мы значительно улучшили воспроизводимость методологии Cell-SELEX в сочетании с инструментами биоинформатики. Мы также показали, что использование биоинформатики сокращает количество циклов выбора, что указывает на большой потенциал вычислительной биологии.

Благодарности

Мы благодарим проф.Доктору Тане Чуфер, доктору Ане Корен и профессору доктору Петру Корошецу, Университетская клиника легочных и аллергических заболеваний Гольник, Словения, за ценные обсуждения. Эта работа была поддержана Словенским исследовательским агентством (программа P1-0245 для TLT и стипендия молодых исследователей для MV) и совместным грантом Национального совета по научному и технологическому развитию (CNPq), Бразилия / Министерства высшего образования, науки и Technology (MHEST), Словения, проект № 4