В контакте р: This browser is no longer supported.

Затем мы спросили, зависит ли повышающая регуляция контакта лизосома-митохондрии в клетках, сверхэкспрессирующих ORP1L, от взаимодействия ORP1L с ER. Сначала мы сравнили формирование контактов лизосома-митохондрии в клетках, сверхэкспрессирующих GFP-ORP1L дикого типа или мутант по мотиву FFAT (D478A), который не может действовать как связующий элемент ER-лизосомы ²² , с клетками, сверхэкспрессирующими GFP.Здесь мы отслеживали контакты лизосома-митохондрии, используя Lamp1-mCherry в качестве лизосомального маркера. Сверхэкспрессия ORP1L, но не мутантного мотива FFAT, показала увеличение как доли, так и продолжительности контактов лизосома-митохондрии (Fig. 3f, g), подтверждая, что сверхэкспрессия ORP1L опосредует контакты лизосома-митохондрии ER-зависимым образом.

Затем мы спросили, необходим ли ORP1L для образования трехсторонних контактов ER-лизосома-митохондрии путем нарушения экспрессии ORP1L.В клетках HeLa, где экспрессия ORP1L была либо истощена (дополнительный рис. 2d), либо нокаутирована (дополнительный рис. 2e), мы наблюдали значительное снижение, но не отмену трехсторонних контактов (рис. 3h, i). Важно отметить, что нокдаун ORP1L не повлиял на долю лизосом, контактирующих с ER (дополнительный рис. 2f), или процент и продолжительность контактов лизосом с митохондриями (дополнительный рисунок 2g, h), что указывает на то, что сниженная доля ER-лизосом Контакты -митохондрии не были вызваны глобальным нарушением контактов ER-лизосома или лизосома-митохондрия.Кроме того, исследования siRNA также предполагают, что в базовых условиях ORP1L не является доминирующим связывающим белком для контакта лизосома-митохондрии. Затем мы проверили, нужны ли партнеры по связыванию ER ORP1L, VAP, для трехсторонних контактов. Нокдаун VAPs приводит к уменьшению трехсторонних контактов (Fig. 3j and Supplementary Fig. 2i), подтверждая, что взаимодействие ORP1L с VAPs играет важную роль в формировании ORP1L-зависимого трехстороннего контакта.

Чтобы подтвердить, что ORP1L непосредственно участвует в формировании подмножества трехсторонних контактов, мы искусственно индуцировали резкое привлечение ORP1L к лизосомам Rab7 в клетках HeLa и отслеживали ER в контактах лизосома-митохондрии как способ оценки трехсторонние контакты.Мы использовали систему димеризации GID1-GAI ²³ , где GAI-ΔANKORP1L, конструкция ORP1L, слитая с GAI, лишенная доменов анкириновых повторов и, следовательно, цитозольная, была задействована в GID1-Rab7-положительных лизосомах после обработки гиббереллином (GA ₃ -AM). это запускало димеризацию GID1 с GAI (Fig. 3k, l). GAI-ΔANKORP1L D478A, мутантная версия ORP1L по FFAT, использовалась в качестве отрицательного контроля. Схематическое резюме методологии, использованной для этого эксперимента, показано на дополнительном рис.2j. Обе конструкции GAI-ΔANKORP1L эффективно рекрутировались в лизосомы Rab7 после обработки гиббереллином (фиг. 3m), но образованию трехсторонних контактов способствовало только рекрутирование GAI-ΔANKORP1L дикого типа (фиг. 3n).

Наконец, чтобы подтвердить специфичность оси Rab7-ORP1L-VAP в формировании контактов ER-лизосома-митохондрии, мы истощили другой лизосомный липидный транспортный белок, STARD3, и отслеживали трехсторонние контакты. STARD3 также обеспечивает контакты ER-лизосомы посредством взаимодействия с VAP, но независимо от Rab7 ²⁴ , и было предложено вносить вклад в формирование контактов лизосома-митохондрии ²⁵ .Мы обнаружили, что нокдаун STARD3 не повторяет потерю трехсторонних контактов, вызванную подавлением ORP1L или VAPs (Supplementary Fig. 2k, l). В совокупности эти данные подтверждают, что ось Rab7-ORP1L-VAPs регулирует формирование субнабора трехсторонних контактов между ER, лизосомами и митохондриями.

Ось Rab7-ORP1L-VAPs регулирует деление митохондрий

Далее мы проверили, необходимы ли трехсторонние контакты, опосредованные взаимодействием Rab7-ORP1L-VAP для деления митохондрий.Недавно было показано, что избыточная экспрессия конститутивно активного Rab7 Q67L нарушает деление митохондрий, указывая тем самым, что гидролиз Rab7 GTP вносит вклад в процесс деления ⁷ . Здесь мы обнаружили, что как избыточная экспрессия либо GTP-заблокированного мутанта Rab7 Q67L, так и доминантно-негативного мутанта Rab7 T22N, заблокированного GDP, снижает скорость деления митохондрий (рис. 4a). Снижение скорости деления митохондрий, особенно в клетках со сверхэкспрессией мутанта T22N, было связано с удлинением митохондрий, увеличением количества митохондриальных соединений и уменьшением количества митохондрий (дополнительный рис.3a – d), что указывает на более высокую степень слияния митохондриальной сети. Это указывает на то, что для деления митохондрий необходим не только гидролиз Rab7 GTP, но и что Rab7 д. Локализоваться в лизосомах. Подобное снижение скорости деления митохондрий наблюдалось также в клетках, лишенных VAP (рис. 4b). Вместе эти результаты подтверждают, что и Rab7, и VAPs необходимы для деления митохондрий.

a , b Нормализованная скорость митохондриального деления (количество митохондриальных делений, нормализованное по времени и объему) в клетках HeLa ( a ), экспрессирующих 3HA-Rab7 дикого типа или мутанты.Клетки из трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Даннета; b , когда уровни экспрессии VAP снижались с использованием миРНК. Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний непарный т -тест. На графиках показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего. c Визуализация живых клеток клеток HeLa, экспрессирующих GFP-ORP1L и mApple-TOM20. Белые и желтые стрелки показывают ORP1L-положительный контакт лизосомы-митохондрии и событие деления митохондрий. Шкала шкалы: 1 мкм. d Процент событий деления митохондрий, которые были отмечены GFP-ORP1L (клетки из двух независимых экспериментов) в клетках HeLa. e Типичные изображения максимальной проекции морфологии митохондрий в клетках HeLa, обработанных указанными миРНК. Масштабные линейки: 10 мкм и 5 мкм (вставка). f — h Морфология митохондрий была определена количественно для f средней площади на митохондрии, g количества митохондрий на интересующую область (ROI) и h количества соединений на митохондрии.Клетки из трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с множественным сравнительным тестом Даннета. На графиках показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего. i , j Нормализованная скорость митохондриального деления клеток HeLa i , обработанных указанными миРНК. Клетки из трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с использованием теста множественного сравнения Даннета и – ORP1L клеток HeLa WT и KO. Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний непарный т -тест. На графиках показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего. k использованных мутантов ORP1L и потеря функции, вызванная мутациями или делециями. l Нормализованная скорость деления митохондрий в клетках ORP1L KO HeLa, экспрессирующих конструкции GFP или GFP-ORP1L и mApple-TOM20. На графиках показано среднее значение ± SEM для клеток из трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с множественным сравнительным тестом Даннета. m Нормализованная скорость деления митохондрий в клетках ORP1L KO HeLa, экспрессирующих mTq2-GAI-ΔANKORP1L, iRFP-GID1-Rab7 и mApple-TOM20, до и после обработки GA ₃ -AM (10 мкМ).Клетки получали изображение через 5-20 мин после обработки GA ₃ -AM. Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний непарный т -тест. На графиках показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Чтобы проверить, требуется ли ORP1L также для деления митохондрий, мы сначала исследовали лизосомы, положительные по ORP1L, в месте деления. Мы обнаружили, что ORP1L-положительные лизосомы были задействованы в 58,1% ( n = 43/74 события из 24 клеток) событий митохондриального деления (рис. 4c, d), что аналогично доле событий деления, отмеченных лизосомами (рис. .1д). Фактически, мы обнаружили, что почти 90% лизосом, маркирующих деление митохондрий, обладают GFP-ORP1L (дополнительный рис. 3e). Когда клетки были истощены по ORP1L, сильное изменение морфологии митохондрий наблюдалось с более удлиненными и гипер слитыми митохондриями (рис. 4e-h), что было связано со сниженной скоростью деления и отсутствием разницы в скорости слияния по сравнению с клетками, обработанными контрольная миРНК (рис. 4i и дополнительный рис. 3f). Аналогичное снижение скорости деления наблюдалось и в клетках ORP1L KO HeLa (рис.4j). Эти изменения не были вызваны снижением уровней ключевых компонентов аппарата деления, таких как Drp1, так как его уровень белка в ORP1L KO клетках не изменился (дополнительный рис. 3g). Сходным образом истощение siRNA ORP1L не влияет на уровни мРНК Drp1 или его адаптера MFF (дополнительный рис. 3h, i). Более того, стимулированное Drp1-зависимое деление митохондрий, вызванное обработкой карбонилцианид-3-хлорфенилгидразоном (CCCP) или сверхэкспрессией митохондриальной заякоренной протеин-лигазы (MAPL) ²⁶ , сильно снижалось в клетках, лишенных ORP1L (дополнительный рис.4а – з). В совокупности эти данные убедительно подтверждают, что взаимодействие Rab7-ORP1L-VAPs необходимо для эффективного деления митохондрий.

ORP1L Липидный транспортный домен необходим для митохондриального деления

Ключевым функциональным доменом ORP1L является его липидный транспортный домен, называемый OSBP-связанным доменом (ORD), который необходим для переноса холестерина ¹⁹ и PI (4) P ²⁷ . Чтобы проверить, требуется ли активность переноса липидов ORP1L для деления митохондрий или он просто действует как связующее звено для трехстороннего контакта ER-лизосома-митохондрия, мы провели эксперименты по комплементации на клетках ORP1L KO HeLa путем повторного введения либо ORP1L дикого типа. или мутанты функционального домена и количественно оценили скорость деления митохондрий.Тремя разными мутантами ORP1L были: (i) конструкция ΔORD, в которой отсутствует домен переноса липидов, (ii) мутант HH / AA, который имеет две мутации в домене ORD, отменяющие его способность извлекать PI (4) P из мембран ²⁷ , и (iii) мутант по мотиву FFAT D478A, который не может взаимодействовать с VAP ²⁷ (фиг. 4k и дополнительная фиг. 5a). Важно отметить, что эти конструкции все еще локализуются в Rab7-положительных лизосомах ²⁷ . Более поздний мутант служил отрицательным контролем, поскольку он не может взаимодействовать с ER, нарушая, таким образом, образование контактов ER-лизосома-митохондрии.И ΔORD, и конструкции HH / AA легко рекрутировались в сайты контакта лизосома-митохондрии на том же уровне, что и конструкции дикого типа (дополнительный рис. 5b, c). Мутант D478A показал значительное уменьшение контакта лизосома-митохондрии, что подтверждает необходимость VAP в формировании сайта контакта лизосома-митохондрии (дополнительный рис. 5c). Однако только ORP1L дикого типа смог улучшить скорость митохондриального деления в клетках ORP1L KO (рис. 4l), что позволяет предположить, что роль ORP1L как в образовании трехсторонних контактов, так и в переносе липидов важна для деления митохондрий. .

Чтобы проверить, участвует ли функция переноса липидов ORP1L непосредственно в делении, и исключить возможность косвенного эффекта потери функции ORP1L, мы быстро задействовали ORP1L в лизосомах в KO-клетках ORP1L с использованием системы GID1-GAI и контролировали скорость деления митохондрий. Рекрутирование GAI-ΔANKORP1L в лизосомы увеличивало скорость митохондриального деления в клетках ORP1L KO (рис. 4m), предполагая, что острого восстановления переноса липидов, опосредованного ORP1L, было достаточно для восстановления деления митохондрий.Вместе наши эксперименты по спасению показывают, что ORP1L необходим не только для образования трехстороннего контакта ER-лизосома-митохондрия в месте деления митохондрий, но также и что его домен переноса липидов необходим для деления митохондрий, что позволяет предположить, что ORP1L переносит липиды во время процесс деления митохондрий.

Лизосомный PI (4) P необходим для деления митохондрий

ORP1L опосредует перенос холестерина из лизосом в ER ¹⁹ и PI (4) P из фаголизосом в ER ²⁷ .Интересно, что среди лизосом, маркирующих сайт митохондриального деления, 83,8% ( n = 26/31 событий из 22 клеток; дополнительный рис. 5d, e) были положительными для зонда холестерина D4H ²⁸ и 82,1% ( n = 32/39 событий из 21 клетки ; (рис. 5a, b) были положительными для зонда PI (4) P 2xP4M ²⁹ . Чтобы проверить, требуется ли перенос холестерина при делении митохондрий, мы истощили NPC1 — ключевой белок в выходе холестерина из лизосом ²⁵ — с помощью миРНК (дополнительный рис.5f), поскольку было показано, что ORP1L требует NPC1 для транспортировки лизосомального холестерина к ER ¹⁹ . Мы обнаружили, что подавление NPC1 не влияет на морфологию митохондрий или скорость деления митохондрий (Supplementary Fig. 5g – k), указывая тем самым, что ORP1L не требуется для переноса холестерина из лизосом в место деления митохондрий.

a Репрезентативное изображение митохондриального деления, отмеченного положительной лизосомой GFP-2xP4M (желтая стрелка) в клетках HeLa, экспрессирующих указанные маркеры.Обработка ингибитором PI4KA GSK-A1 позволила лучше визуализировать PI (4) P в лизосомах. Шкала шкалы: 1 мкм. b Процент событий деления митохондрий, отмеченных лизосомами (клетки из двух независимых экспериментов), и лизосом, отмеченных GFP-2xP4M в событиях деления митохондрий. c В ORPSAC1 домен ORD ORP1L был заменен каталитическим доменом Sac1, позволяющим дефосфорилировать лизосомный PI (4) P. d Типичные изображения максимальной проекции морфологии митохондрий в клетках HeLa, сверхэкспрессирующих указанные конструкции.Масштабные линейки: 10 мкм и 5 мкм (вставка). e — g Морфология митохондрий была определена количественно для e средней площади на митохондрии, f количества митохондрий на интересующую область (ROI) и g количества соединений на митохондрии. Клетки из трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с множественным сравнительным тестом Даннета. ч Нормализованная скорость деления митохондрий в клетках HeLa, сверхэкспрессирующих указанные конструкции. Клетки из трех независимых экспериментов.Односторонний дисперсионный анализ с множественным сравнительным тестом Даннета. i Цитозольный GAI-Sac1 может быть задействован в лизосомах GID1-Rab7 после обработки GA ₃ -AM для специфического истощения лизосомного PI (4) P. j , k Типичные изображения клеток HeLa, экспрессирующих CFP-GAI-Sac1 или каталитически мертвый мутант C392S, iRFP-GID1-Rab7 и mCherry-2xP4M после обработки GA ₃ -AM ( j ). Масштабные линейки: 10 мкм и 1 мкм (вставка). k Количественная оценка лизосомных уровней 2xP4M, нормализованных по уровням плазмалеммы.Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний непарный т -тест. l Нормализованная скорость деления митохондрий до или после обработки GA ₃ -AM в клетках HeLa, сверхэкспрессирующих iRFP-GID1-Rab7, и указанных конструкциях. Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний дисперсионный анализ, критерий множественных сравнений Сидака. m Репрезентативное изображение клетки HeLa, экспрессирующей GFP-PI4K2B и Lamp1-mCherry, с увеличенной вставкой белого квадрата на панели слияния. Шкала шкалы: 10 мкм. n Нормализованная скорость деления митохондрий в клетках HeLa, обработанных указанными миРНК. Клетки из трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с множественным сравнительным тестом Даннета. e — h , k , l , n Все графики показывают среднее значение ± SEM.

Как было недавно показано, продукция PI (4) P в Гольджи играет решающую роль в делении митохондрий ⁶ , и лизосомы, маркирующие события деления митохондрий, были положительными для зонда PI (4) P 2xP4M (рис.5а, б), мы предположили, что ORP1L может опосредовать перенос PI (4) P из лизосом в место деления митохондрий. Чтобы проверить это, мы использовали ранее проверенную химерную конструкцию ORPSAC1 ²⁷ , в которой домен ORD ORP1L был заменен каталитическим доменом Sac1, фосфатазы, которая дефосфорилирует PI (4) P. Это позволило нам проверить, нарушает ли специфическое истощение PI (4) P в цитозольном листке лизосомальной мембраны деление митохондрий (Fig. 5c). Сверхэкспрессия ORP1L дикого типа и ORPSAC1 привела к значительному снижению сигнала 2xP4M на ORP1L-положительных лизосомах по сравнению с избыточной экспрессией мутантного ORP1L HH / AA, который не может экстрагировать PI (4) P (дополнительный рис.6а, б). Эти результаты подтверждают, что ORPSAC1 способен истощать PI (4) P в лизосомах и что, как ранее сообщалось ²⁷ , ORP1L регулирует уровни PI (4) P в лизосомах, вероятно, путем переноса его в другие компартменты. Затем мы исследовали морфологию митохондрий в клетках, сверхэкспрессирующих GFP-ORPSAC1, и обнаружили, что он был сильно удлиненным и гиперслитым (рис. 5d – g), и эти клетки показали значительно более низкую скорость деления митохондрий (рис. 5h) по сравнению с клетками. сверхэкспрессия GFP или GFP-ORP1L.ORPSAC1-положительные лизосомы контактировали с митохондриями с той же частотой и продолжительностью, что и ORP1L-положительные лизосомы дикого типа, что позволяет предположить, что его сверхэкспрессия не изменяет контакты лизосома-митохондрии (дополнительный рис. 6c, d) и не нарушает локализацию ORP1L в лизосомы (дополнительный рис. 6e). Кроме того, ORPSAC1-положительные лизосомы наблюдались в контакте с mApple-Drp1 puncta в сайтах сужения митохондрий (дополнительный рис. 6f), что указывает на то, что истощение PI (4) P не препятствовало рекрутированию лизосом в сайты сужения митохондрий.

Чтобы подтвердить необходимость лизосомального PI (4) P в делении митохондрий и исключить потенциальный эффект длительного истощения лизосомального PI (4) P, который может косвенно влиять на деление митохондрий, мы резко снизили уровень PI (4) P в Rab7-положительных лизосомах путем нацеливания цитозольного Sac1 на лизосомы с использованием системы GID1-GAI (фиг. 5i). Рекрутирование Sac1 дикого типа, но не каталитически мертвого мутанта C392S, привело к снижению уровней 2xP4M в лизосомах (рис. 5j, k), а также к снижению скорости деления митохондрий (рис.5l), демонстрируя, что острое истощение PI (4) P на лизосомальной мембране нарушает деление митохондрий. Наконец, мы проверили, подавляет ли ингибирование продукции PI (4) P в лизосоме деление митохондрий. Было высказано предположение, что лизосомный PI (4) P генерируется фосфатидилинозитол-4-киназами II типа (PI4K), такими как PI4K2A и PI4K2B ^30,31,32 . GFP-меченный PI4K2B, локализованный в лизосомах (рис. 5m), и подавление PI4K2B (дополнительный рис. 7a) приводили к снижению уровней 2xP4M в лизосомах (дополнительный рис.7b), что согласуется с ролью PI4K2B в продукции лизосомного PI (4) P. Количественная оценка скорости деления митохондрий в клетках с нокдауном PI4K2B показала пониженную скорость деления и значительную гиперфузию митохондриальной морфологии (Fig. 5n и Supplementary Fig. 7c-f) по сравнению с клетками, обработанными контрольной siRNA. В совокупности наши результаты указывают на критическую роль лизосомального PI (4) P в делении митохондрий и предполагают, что ORP1L обеспечивает перенос PI (4) P во время этого процесса.

Восстановление переноса PI (4) P из лизосом восстанавливает морфологию митохондрий в клетках, истощенных по ORP1L

Чтобы подтвердить, что перенос лизосомного PI (4) P через трехсторонний контакт ER-лизосома-митохондрия необходим для деления митохондрий, мы истощили клетки HeLa ORP1L с помощью siRNA и проверили, может ли восстановление переноса PI (4) P из лизосом восстановить морфологию митохондрий, вызванную истощением ORP1L.Для этого мы создали химерный белок, который мы назвали ORPOSBP, в котором N-конец OSBP был заменен N-концом ORP1L, который содержит Rab7-связывающие анкириновые повторы (рис. 6a). OSBP — это хорошо зарекомендовавший себя белок-переносчик PI (4) P, который обеспечивает его перенос в сети транс-Гольджи — ER ^33,34 и в сайтах контакта эндолизосомы-ER ^35,36 .

a ORPOSBP — это химерный белок, состоящий из аминокислот 1–335 ORP1L, слитых с аминокислотами 184–809 OSBP из Oryctalogus cuniculus . Домены не масштабируются. b Типичное изображение клетки Hela, экспрессирующей GFP-ORPOSBP и mRFP-Rab7. Увеличенное изображение пунктирной рамки показано справа. Масштабные линейки: 10 мкм и 5 мкм (вставка). c Покадровые изображения клеток HeLa, экспрессирующих GFP-ORPOSBP и mApple-TOM20. Желтая стрелка показывает событие деления митохондрий, отмеченное GFP-ORPOSBP.Шкала шкалы: 1 мкм. d , e Типичные изображения клеток HeLa, экспрессирующих GFP-ORPOSBP дикого типа или мутант HH / AA с дефицитом связывания липидов с зондом PI (4) P mCherry-2xP4M ( d ). Масштабные линейки: 10 мкм и 1 мкм (вставка). e Количественная оценка лизосомных уровней 2xP4M, нормализованных по уровням плазмалеммы зонда. На графиках показано среднее значение ± SEM для клеток из трех независимых экспериментов. Двусторонний непарный т -тест. f Типичные изображения максимальной проекции морфологии митохондрий в клетках HeLa, обработанных siRNA, подавляющими ORP1L и сверхэкспрессирующими GFP, GFP-ORPOSBP или мутант HH / AA ORPOSBP и mApple-TOM20.Обратите внимание, что экспрессия ORPOSBP дикого типа, но не экспрессия мутанта HH / AA, спасает удлинение митохондрий и гиперфузию митохондриальной сети, вызванную истощением ORP1L. Масштабные линейки: 10 мкм и 5 мкм (вставка). г — i Морфология митохондрий была определена количественно для г средней площади на митохондрии, h количества митохондрий на интересующую область (ROI) и i количества соединений на митохондрии. Клетки из трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Даннета, статистически не значимый: g p = 0.6437, h p = 0,7205 и i p = 0,3046. На графиках показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего. j — l Морфология митохондрий клеток Hela, экспрессирующих GFP или GFP-ORPOSBP, была количественно определена для j средней площади на митохондрии, k количества митохондрий на интересующую область (ROI) и l количества соединений на митохондрии. Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний непарный t -тест, статистически недостоверный. j p = 0,8011, k p = 0,6381 и l p = 0,9266. На графиках показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

При сверхэкспрессии в клетках ORPOSBP почти исключительно локализуется в Rab7-положительных лизосомах (фиг. 6b), которые обнаруживаются в сайтах деления митохондрий (фиг. 6c). Кроме того, клетки, экспрессирующие ORPOSBP, показали более низкие уровни 2xP4M в лизосомах по сравнению с мутантом HH / AA, который отменяет способность OSBP извлекать PI (4) P из мембран ³⁷ (рис.6d, e), демонстрируя, что ORPOSBP способен способствовать переносу PI (4) P из лизосом. Важно отметить, что экспрессия ORPOSBP, но не мутанта HH / AA, была достаточной для восстановления изменений морфологии митохондрий, вызванных RNAi-опосредованным истощением ORP1L (Fig. 6f-i). Однако ORPOSBP не влиял на морфологию митохондрий в контрольных клетках (Fig. 6j-l), подобно сверхэкспрессии ORP1L (Fig. 5e-g). Таким образом, наши данные подтверждают, что ORP1L опосредует перенос PI (4) P из лизосом, чтобы способствовать делению митохондрий.

Рекрутирование PI (4) P фосфатазы Sac1 в митохондрии нарушает их деление

Далее мы исследовали, может ли сайт деления митохондрий быть реципиентом лизосомного PI (4) P во время митохондриального деления. Поскольку любой PI (4) P, переносимый в ER, быстро превращается в PI с помощью локализованного в ER SAC1 ³⁸ , мы пришли к выводу, что ORP1L, вероятно, переносит PI (4) P на митохондриальную мембрану во время деления митохондрий. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сначала спросили, требуется ли PI (4) P для деления митохондрий путем истощения PI (4) P в сайте деления путем нацеливания на каталитический домен Sac1 с использованием системы димеризации GAI-GID1, где GID1 был слит. к белку внешней мембраны митохондрий MFF, который рекрутирует Drp1 в сайт деления ⁹ (рис.7а, б). Острое привлечение каталитического домена Sac1, но не каталитически мертвого мутанта C392S, в сайты деления митохондрий привело к заметному снижению скорости деления митохондрий (Fig. 7c). Более того, через 6 часов после нацеливания Sac1 на сайты митохондриального деления это привело к значительному увеличению элонгации митохондрий и гиперфузии митохондриальной сети (Supplementary Fig. 8a-d). Однако рекрутирование каталитически мертвого Sac1 C392S не влияет на морфологию митохондрий, указывая тем самым, что наблюдаемые эффекты зависят от каталитической активности Sac1.Чтобы дополнительно подтвердить необходимость PI (4) P в месте деления, мы экспрессировали слитый белок Sac1-MFF, чтобы закрепить каталитический домен Sac1 на внешней мембране митохондрий (Fig. 7d). Клетки, экспрессирующие GFP-Sac1-MFF, обнаруживают повышенное удлинение и гиперфузию митохондриальной сети (рис. 7e-h) по сравнению с контрольными клетками, сверхэкспрессирующими только GFP, каталитически мертвыми GFP-Sac1 C392S-MFF или GFP-MFF. Вместе эти результаты предполагают, что PI (4) P необходим в месте деления митохондрий и играет решающую роль в процессе деления.

a Растворимый GAI-Sac1 может быть рекрутирован в сайт деления митохондрий с использованием GID1-MFF после обработки GA ₃ -AM, что приводит к дефосфорилированию PI (4) P в сайте деления митохондрий. b Типичное изображение клетки HeLa, экспрессирующей CFP-GAI-Sac1, iRFP-GID1-MFF (без изображения) и mApple-TOM20 до и после обработки GA ₃ -AM (10 мкМ).Шкала шкалы: 10 мкм. c Нормализованная скорость деления митохондрий до и после обработки GA ₃ -AM (10 мкМ) в клетках HeLa, сверхэкспрессирующих CFP-GAI-Sac1 дикого типа или неактивный мутант C392S, iRFP-GID1-MFF и mApple-TOM20 . При обработке GA _{3 клетки} -AM (10 мкМ) отображали между 5 и 25 мин обработки. Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний дисперсионный анализ, критерий множественных сравнений Сидака. d В GFP-Sac1-MFF, Sac1 был слит с MFF, чтобы закрепить его непосредственно на внешней митохондриальной мембране, что привело к дефосфорилированию PI (4) P в сайте деления митохондрий. e Типичные изображения максимальной проекции клеток HeLa, экспрессирующих GFP, GFP-MFF, GFP-Sac1-MFF или каталитически неактивные GFP-Sac1 C292S-MFF и mApple-TOM20. На вставке показана морфология митохондриальной сети. Масштабные линейки: 10 мкм и 5 мкм (вставка). f — h Морфология митохондрий была определена количественно для f средней площади на митохондрии, g количества митохондрий на интересующую область (ROI) и h количества соединений на митохондрии.Клетки из трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с множественным сравнительным тестом Тьюки. i Типичные изображения клеток ORP1L KO HeLa, экспрессирующих указанные конструкции, до и после обработки GA ₃ -AM (10 мкМ). Шкала шкалы: 10 мкм. j Нормализованная скорость митохондриального деления в клетках ORP1L KO HeLa, экспрессирующих цитозольный mTq ² -GAI-ΔANKORP1L D478A, mApple-TOM20, GFP-ORP1LΔORD и iRFP-GID1-Rab7 до и после GA762 _{3 10 мкМ) обработки.Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний непарный t-критерий. k Нормализованная скорость митохондриального деления в клетках ORP1L KO HeLa, экспрессирующих цитозольный mTq ² -GAI-ΔANKORP1L D478A, mApple-TOM20 и iRFP-GID1-Rab7 до и после обработки GA 3 -AM (10 мкМ). Клетки из трех независимых экспериментов. Двусторонний непарный т -тест. c , f — h , j , k Все графики показывают среднее значение ± SEM.ns несущественно: f p = 0,7632, g p = 0,3592, h p = 0,7935 и k p = 0,5192.}

Чтобы проверить, достаточно ли продукции PI (4) P в сайте деления митохондрий для ускорения деления, мы нацелили каталитический домен PI4KA (PI4KAc1001) на сайт деления (дополнительный рис. 8e) и контролировали скорость деления в обоих. контроль и в клетках ORP1L KO. Как было продемонстрировано ранее ³⁹ , привлечение каталитического домена PI4KA (PI4KAc1001) в митохондрии приводит к продукции PI (4) P в митохондриях (дополнительный рис.8е, г). Однако это не влияет на скорость деления митохондрий в контроле или в клетках ORP1L KO (Supplementary Fig. 8h, i), указывая тем самым, что увеличения только PI (4) P в митохондриях недостаточно для стимулирования их деления. Этот результат указывает на то, что синхронизированное увеличение PI (4) P в месте деления митохондрий может быть критическим для управления делением митохондрий.

VAPs-независимый транспорт липидов ORP1L достаточен для восстановления митохондриального деления в ORP1L KO-клетках

Перенос липидов ORP1L между ER и лизосомой в Rab7-ORP1L-VAPs, опосредованном контактным сайтом ER-лизосомы, требует связывания ORP1L с VAP ¹⁹ .Однако Rab7 также участвует в формировании сайта контакта мембраны с митохондриями, поскольку его взаимодействие с митохондриальным локализованным белком TBC1D15 управляет его гидролизом GTP, чтобы развязать две органеллы ⁷ . Поскольку ORP1L связывается непосредственно с Rab7, мы предполагаем, что ORP1L может напрямую транспортировать лизосомный PI (4) P к митохондриям в контактах лизосома-митохондрии, индуцированных привлечением лизосом к участку митохондриального деления. Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали, может ли ORP1L, локализованный в лизосоме, который не может связываться с VAP, но все еще способный связываться с Rab7, спасти деление митохондрий в клетках ORP1L KO.Поскольку взаимодействие ORP1L-VAPs необходимо для рекрутирования лизосом в сайт митохондриального деления, мы котрансфицировали клетки ORP1L KO как мутантом FFAT ORP1L D478A, так и мутантом ORD с делецией ORP1LΔORD. Обе конструкции не могут спасать клетки ORP1L KO по отдельности (фиг. 4l). Чтобы различить активность этих конструкций, мы нацелили мутант FFAT (GAI-ΔANKORP1L D478A) на лизосомы с использованием системы димеризации GID1-GAI. Мы обнаружили, что только клетки с обеими конструкциями в лизосомах показали повышенную скорость деления митохондрий в клетках ORP1L KO (рис.7i, j). Однако один только GAI-ΔANKORP1L D478A в лизосоме не способен восстанавливать деление митохондрий (фиг. 7k). Эти результаты предполагают, что ORP1L может переносить липиды без связывания с VAP, тем самым обеспечивая дополнительную поддержку ORP1L в качестве переносчика PI (4) P в контакте лизосома-митохондрия во время деления митохондрий.

Контактные телефоны / Департамент социальных служб Миннесоты

A | B | C | D | E | F | G | H | Я | J | K | L | M | N | O | P | Q | R | S | Т | U | V | W | X | Y | Z

А

Принятие, 651-431-4656
Дневной уход для взрослых

Приемная семья для взрослых

Психическое здоровье взрослых, 651-431-2225
Психиатрические услуги для взрослых

• Метро, ​​763-548-КРОВ
• Большая Миннесота, 866-966-BEDS

Служба защиты взрослых, 651-431-2609

• Горячая линия программы, 800-657-3761

Отдел по борьбе со злоупотреблением алкоголем и наркотиками, 651-431-2460
Альтернативный уход (AC)

B

Возмещение пособий, 651-431-3100

• Бесплатная линия 800-657-3963

Льготы по специальному взысканию льгот, 651-431-3204
Совет по старению, 651-431-2500

Анализ бюджета, 651-431-2930

С

Central Pre-Admission (Прямая помощь и лечение), 651-431-5337

• Бесплатная линия для Большой Миннесоты: 866-966-BEDS (2337)

Химическое здоровье — см. Отдел по борьбе с алкоголем и наркотиками
Жестокое обращение с детьми / безнадзорность, 651-431-4661
Обследование детей и подростков, 651-431-5655
Алименты (общая информация), 651-431-4400

• Бесплатная линия (АТС), 800-657-3890

Центр выплаты алиментов — Выплаты алиментов
Услуги для детей и семьи, 651-431-3836
Услуги для детей, 651-431-4660
Психическое здоровье детей, 651-431-2321
Гражданские права, 651-431-3040

Офис комиссара, 651-431-2907
Сообщество жизнеобеспечения, 651-431-3809
Общественное партнерство, 651-431-3809
Служба поддержки сообщества, 651-431-2460
Программа компульсивных азартных игр, 651-431-2245
Consumer Support Grants (CSG), 651-431-4300
Постоянный уход за инвалидами, 651-431-2400

D

Отдел обслуживания глухих и слабослышащих, 800-657-3663, голосовая связь или предпочитаемая вами ретрансляционная служба, 651-964-1514 видеотелефон

Справочная служба DHS, 651-431-2000

Служба безопасности DHS, 651-431-3000

Центр инвалидов MN, 866-333-2466

Отдел обслуживания инвалидов, 651-431-4300 или по бесплатному телефону 866-267-7655

Дискриминация, 651-431-3040

Лекарства (помощь по рецептам), 800-333-2433 (Senior LinkAge Line)

E

Экономическая помощь, 651-431-4000;
Отказ от прав пожилых людей (EW)

Электронный перевод пособий (EBT), 888-997-2227
Электронный обмен данными, 651-431-2700

• Бесплатная линия, 800-366-5411

Равный доступ к программам или услугам (EOAA), 651-431-3040
Управление равных возможностей, 651-431-3040

F

Служба поддержки семьи и детей, 651-431-4660
Справедливое обращение, 651-431-3040
Финансовые операции, 651-431-3725
Продовольственная поддержка (ранее — продовольственные талоны), 651-431-4049

• Бесплатная линия, 800-657-3698

Продовольственная поддержка, трудоустройство и обучение (FSET), 651-431-4027
Формы, 651-431-3502
Приемная семья для детей, 651-431-4660
Горячая линия по борьбе с мошенничеством для поставщиков медицинских услуг и выставления счетов

• метро Twin Cities, 651-431-2650
• Бесплатная линия, 800-657-3750

Горячая линия для получателей по борьбе с мошенничеством

• метро Twin Cities, 651-431-3968
• Бесплатная линия, 800-627-9977
  

G

Горячая линия по проблемам азартных игр в Миннесоте, 800-333-HOPE
Программа компульсивных азартных игр, 651-431-2245
Групповое жилищное строительство, см. Службы поддержки жилищного строительства

H

Право на получение медицинских услуг и доступ к ним, 651-431-2283

• Бесплатная линия, 888-938-3224

Система проверки права на получение медицинской помощи

• Только провайдеры, 651-431-4399
• Бесплатная линия, 800-657-3613
• только для членов, 651-431-2670
• Бесплатная линия, 800-657-3739

Отделение здравоохранения, 651-431-3100

• Бесплатная линия, 800-657-3963

Программы здравоохранения, 651-431-2478

• Медицинская помощь (Medicaid), 651-431-2670
  • Бесплатная линия, 800-657-3739
• MinnesotaCare, 651-297-3862
  • Бесплатная линия, 800-657-3672
• Окружные и племенные отделения
Служба поддержки участников
• , 651-431-2670
  • Бесплатная линия, 800-657-3739
• Омбудсмен по программам государственного управления, 651-431-2660
  • Бесплатная линия, 800-657-3729
Телефонный центр поставщика услуг
• , 651-431-2700
  • Бесплатная линия, 800-366-5411
Регистрация провайдера
• , 651-431-2700
  • Бесплатная линия, 800-366-5411
  • Факс, 651-282-5100

Горячая линия по борьбе с мошенничеством с поставщиками медицинских услуг

• метро Twin Cities, 651-431-2650
• Бесплатная линия, 800-657-3750

Консультация по страхованию здоровья, 800-333-2433

Исследования и качество здравоохранения, 651-431-2629
Закон о переносимости и подотчетности медицинского страхования (HIPAA), 651-431-2700
Программы по ВИЧ / СПИДу, 651-431-2414

• Горячая линия программы, 800-657-3761

Housing Resources Toolbox, 651-297-1216
Служба жилищной поддержки, 651-431-3941
Отдел кадров, 651-431-2990

• Бесплатная линия, 800-657-3509

я

Indian Policy, Office of, 651-431-2910
Услуги индивидуальной образовательной программы (IEP) и программы здравоохранения Миннесоты, 651-431-2622
Младенцы и дети с ограниченными возможностями, 651-431-2400
Справочная, 651-431-2000
Информационные технологии, 651-431-2110
Служба внутреннего аудита, 651-431-3623
Переводчики для глухих и слабослышащих — услуги ретранслятора, 800-627-3529
Генеральный инспектор, Управление, см. Управление Генерального инспектора

Дж

К

L

Законодательный аудит, 651-431-2281
Лицензирование, 651-431-6500
LinkVet, 888-LINKVET или 888-546-5838
Консультация по долгосрочному уходу

M

Management Services, 651-431-3501
Медицинская помощь (Medicaid), 651-431-2670

Психическое здоровье — взрослые, 651-431-2225
MinnesotaCare, 651-297-3862

• Бесплатная линия, 800-657-3672
• Факс, 651-431-7500

Миннесотский центр сообщений о жестоком обращении со взрослыми, 844-880-1574 (круглосуточно, без выходных)
Миннесотский совет по вопросам старения, 651-431-2500

Программа семейных инвестиций Миннесоты (MFIP), 651-431-4000
Программа планирования семьи Миннесоты, 651-431-3480

• Бесплатная линия, 888-702-9968

Программа продовольственной помощи Миннесоты (MFAP), 651-431-4049
MinnesotaHelp.Информация

Миннесота SeniorCare Plus, 651-431-2517
Minnesota Senior Health Options (MSHO), 651-431-2517
Миннесотская программа для сексуальных преступников (MSOP), 651-431-5800
Государственные общественные службы Миннесоты (MSOCS), 651-776-4117
Minnesota Supplemental Aid (MSA), 651-431-4049

N

Тарифы и правила медицинского учреждения, 651-431-2281

O

Управление экономических возможностей, 651-431-3808
Управление индийской политики, 651-431-2910
Офис генерального инспектора, 651-431-6630

• Бесплатная линия, 855-277-5407

Офис омбудсмена по долгосрочному уходу, 651-431-2555

• Бесплатная линия, 800-657-3591

Омбудсмен по программам государственного управления здравоохранением, 651-431-2660

• Бесплатная линия, 800-657-3729
  

п.

Родительские сборы, 651-431-3806

• Бесплатная линия, 800-657-3751

Измерение частоты ошибок при оплате (PERM), 651-431-4279
Измерение эффективности и повышение качества (см. Исследования и качество здравоохранения)
Аптека — Программы здравоохранения Миннесоты (MHCP), 651-431-2504
Программа предварительного обследования, 651-431-2579
Оценка программы и целостность (PAID), 651-431-3936
Апелляции провайдера, 651-431-2700
Регистрация провайдера, 651-431-2700

• Бесплатная линия, 800-366-5411
• Факс, 651-431-7462

Информационный центр поставщика медицинских услуг (программы здравоохранения), 651-431-2700

• Бесплатная линия, 800-366-5411

Горячая линия поставщиков медицинских услуг и мошенничества при выставлении счетов (медицинская помощь), 651-431-2650
Закупки и предоставление услуг (здравоохранение), 651-431-2478

Q

R

S

Служба безопасности в DHS, 651-431-3000
Senior LinkAge Line, 800-333-2433
Горячая линия по надзору и проверке целостности (SIRS), 651-431-2650

• Бесплатная линия, 800-657-3750

Информационная система социальных служб, 651-431-4800
SOS Central Pre-Admission, 651-431-5337

• Бесплатная линия для Большой Миннесоты: 866-966-BEDS (2337)

Special Needs BasicCare (SNBC), 651-431-2516
Специальная секция восстановления, 651-431-3204
Специальный транспорт

• Информационный центр поставщика услуг, 651-431-2700
• Бесплатная линия, 800-366-5411
• Служба поддержки участников MHCP, 651-431-2670
• Бесплатная линия, 800-657-3739

Группа государственной медицинской экспертизы, 651-431-2493
Служба государственной службы поддержки, 651-431-3676

Т

(TAP), позвоните в местную телефонную компанию, чтобы подать заявку

• Бесплатная линия, 800-657-3663
• Видеотелефон, 651-964-1514 VP

Лечебные центры, областные, 651-431-3676

U

Недобросовестное обращение, 651-431-3040

В

• Дисквалификация за мошенничество, 651-431-3999

Линия связи для ветеранов, 888-LINKVET, 888-546-5838
Виртуальное присутствие, 651-431-2070

Вт

Горячая линия по борьбе с мошенничеством в сфере социального обеспечения

• метро Twin Cities, 651-431-3968
• Бесплатная линия, 800-627-9977
  

Х

Y

Z

Существует ли омический контакт p-типа в интерфейсах WSe2 – металл?

Формирование металлических контактов с низким сопротивлением — самая большая проблема, которая маскирует присущие исключительным электронным свойствам двумерные устройства WSe ₂ .Мы представляем первое сравнительное исследование межфазных свойств между монослоем / бислоем (ML / BL) WSe ₂ и контактами Sc, Al, Ag, Au, Pd и Pt с использованием ab initio расчетов энергетических зон с включением эффектов спин-орбитальной связи (SOC) и моделирования квантового переноса. Межслоевое взаимодействие имеет тенденцию уменьшать высоту как электронного, так и дырочного барьера Шоттки (SBH) и изменяет полярность контакта WSe ₂ –Au, в то время как SOC в основном уменьшает дырочный SBH.В отсутствие SOC контакт Pd имеет наименьшее отверстие SBH. В значительной степени контакт Pt превосходит контакт Pd и становится омическим или квазиомическим контактом p-типа с включением SOC. Следовательно, омический или квазиомический контакт p-типа существует в интерфейсах WSe ₂ –металл. Наше исследование обеспечивает теоретическую основу для выбора подходящих металлических электродов в устройствах ML / BL WSe ₂ .

У вас есть доступ к этой статье

Свяжитесь с нами

Свяжитесь с нами | Мерримак Колледж

Поиск по отделу

AllAcademic Affairs / ProvostAcademic Success CentreОтдел бухгалтерского учета и финансовПлатежные счетаАдминистрацияПриемная комиссияАтлетический отделКнижный магазинКнижный магазинКабинетный кабинетКампус LifeCampus Ministry Школа ОбразованияДекан Студенческого УправленияРазработка и отношения с выпускникамиРазнообразное образованиеОтдел экономикиОбразованиеОтдел электрооборудования и компьютерной инженерииАнглийский департаментУправление зачислениемУслугиСенат факультетаОфис по финансовой помощиФискальные вопросыГенеральный советникОтдел глобального образованияПрием в аспирантуруОтдел послевузовского образованияДепартамент здравоохранения Департамента здравоохраненияФорма здравоохранения Ion Technology ServicesИнституциональные исследования и планированиеМеждународная студенческая группаПоддержка иностранных студентовИудейские / христианские / мусульманские отношения, Центр по обучениюJumpstartMACK Card OfficeMACK Print CentreОтдел управленияМаркетинговый департаментМатематический отделБиблиотека McQuadeМеханический инженерный отделМиссионерские и студенческие вопросыОфис по вопросам политики и развития карьерыПолитика по вопросам заработной платы и Департамент политософииОтдел по политологии Управление рискамиПрофессиональное обучение и непрерывное обучение, Отдел психологии, Офис регистратора, Религиозные и теологические исследования, Офис Жизни, Центр искусств Роджерса, Кампусный центр Саковича, Департамент социологии, Sodexo, Спортивная медицина, Учебный центр Службы Стивенса, Вовлечение студентов, Телекоммуникации, Репетиторство и Математика, Центр изучения гендерных вопросов, Центр прикладного обучения и математики, Центр визуальных и математических исследований 9

611 Crimin , Ash Center