Как узнать кто смотрит твои записи в вк: Как узнать кто смотрел запись Вконтакте по новому счетчику просмотров?

Можно ли в Тик токе посмотреть кто посмотрел твои видео

Тик ток завоевал популярность пользователей. Сеть, предназначена для просмотра роликов и выкладывания собственных видео.

О приложении складывается неоднозначное мнение, кто-то от него без ума, любят смотреть и выкладывать собственные ролики, а кто-то его терпеть не может.

Приложением пользуется более 500 млн. человек. Чтобы начать выкладывать собственные видео необходимо в первую очередь скачать приложение, установить и зарегистрироваться.

Чтобы начать снимать собственное видео, необходимо кликнуть на иконку плюс. Тогда откроется окно, в котором можно записывать видео.

Тик ток дает возможность использовать красивые и смешные маски и различное звуковое сопровождение. При записи видео в режиме реального времени, можно сразу выбрать музыкальное сопровождение.

К преимуществам приложения можно отнести:

• разнообразный звуковой фильтр;
• возможность размещать видео в социальных сетях;
• хорошая площадка для раскрытия своего креатива.

Посетители и гости профиля

Многим бывает интересно, сколько человек заходило на их профиль и поставили лайки. Разработчики добавили к функциям мобильного приложения опцию отслеживания активности других пользователей, которые совершали действия на аккаунте.

Чтобы отследить тех, кто бывал на аккаунте, необходимо:

• войти в приложение;
• справой стороны от панели находится иконка в виде сообщения, на нее нужно кликнуть;
• теперь должна появиться кликабельная строка;
• после нажатия на нее появится меню;
• в нем нужно выбрать раздел «входящие».

После проделанных действий на кране появится список тех, кто заходит на аккаунт.

Однако, можно еще узнать, кто из пользователей не просто заходил в профиль, а изучал его. Для того необходимо выполнить следующие действия:

Кликнуть на верхнее уведомление и там появится список всех тех, кто заходил на аккаунт и просматривал его.

Те, кто попробовали, понимают, насколько она полезна. Теперь можно быть в курсе тех, кто посещает аккаунт, какой контент им интересно смотреть. Исходя из того можно выкладывать такие ролики, которые будут интересны именно им.

Возможно, ли посмотреть тех, кто смотрел видео

Просмотреть число человек, посещавших профиль можно через PRO-аккаунт. Но узнать число человек, поставивших лак, немного сложнее.

Чтобы увидеть в тик ток лайкнувшие записи, необходимо:

• войти в приложение и авторизоваться;
• зайти в раздел входящие и кликнуть на раздел «лайки»;
• появится список тех публикаций, которые были пролайканы.

Здесь можно просматривать информацию о лайках и комментариях, оставленных под публикацией. Отображается информация и об отзывах, которые оставили пользователи.

Отдельный раздел отведен видеоклипам, которые пролайкал сам владелец аккаунта.

Чтобы просмотреть такие посты, необходимо:

• открыть приложение и перейти в раздел «мой профиль»;
• кликнуть на посты, которые понравились.

Настройки и статистика PRO-аккаунт

PRO настройки представляют собой расширенные функции для блогеров и тех аккаунтов,  которые строят коммерческую деятельность в сети. Открыть себе категорию премиум можно бесплатно в разделе «параметры».

Чтобы открыть статистику, необходимо:

• зайти в приложение в раздел «настройки»;
• кликнуть на графу управление аккаунтом и пролистать список вниз;
• перейти на PRO аккаунт.

Теперь должно открыться окно, в котором отобразится вся статистика по странице.

Просматривать число посетителей и понравившейся им контент нужно тем, кто хочет получить больше подписчиков и лайков, ведь если они будут выкладывать те, видео, которые привлекают внимание большого числа пользователей, то и посещаемость страницы увеличится в несколько раз.

Как узнать, кто сохранил ваш номер в Telegram

Telegram становится все более популярным сервисом обмена сообщениями, похожим на WhatsApp и Messenger. Он утверждает, что он намного быстрее и безопаснее, чем остальные конкуренты. Возможно, это на бумаге, но все же не идеально. Поскольку вам необходимо предоставить действующий номер телефона, чтобы подписаться на Telegram.

Другие пользователи могут злоупотребить этим фактом и получить доступ к вашему номеру телефона через это приложение. Если вы хотите узнать, как узнать, кто сохранил ваш номер в Telegram, вы попали в нужное место. Продолжайте читать, и вы точно узнаете это, а также другую полезную информацию и советы по безопасности.

Как это работает

Использовать Telegram действительно просто. Во-первых, вам нужно скачать приложение с официального Веб-сайта. Его поддерживают все основные платформы. После этого процесс регистрации становится проще простого. Вы сразу заметите, что вас просят указать номер телефона. Затем вам нужно будет подтвердить сам номер телефона.

Хорошо, и что, многие другие приложения запрашивают у вас ваши личные данные при регистрации. Что ж, это приложение утверждает, что оно чрезвычайно безопасно. Может ли безопасное приложение так легко выдавать телефонные номера своих пользователей? Вероятно, нет.

Если вы нам не верите, можете это проверить. Собственно, мы расскажем, как узнать, у кого есть ваш номер в Telegram, и как отключить эту бессмысленную функцию. Для такого безопасного приложения кажется крайне неразумным по умолчанию передавать ваш номер телефона вашим контактам.

Будьте осторожны в Интернете; люди не всегда те, кем они себя называют. Не связывайтесь ни с кем в таких приложениях, как Telegram. Другие пользователи могут видеть ваш номер телефона, если вы видите их.

Как узнать наверняка

Это похоже на то, что он сказал, она сказала ситуацию, но это реальность. Telegram дает каждому в вашем списке контактов ваш номер, и вы сами можете это увидеть. Следуй этим шагам:

1. Запустите Telegram на своем устройстве (компьютер, планшет, смартфон, неважно).
   
2. Коснитесь трех линий в верхнем левом углу экрана.
   
3. Кликните “Настройки”.
   
4. Выберите настройки конфиденциальности и безопасности.
   
5. Наконец, посмотрите на Синхронизацию контактов. Если ползунок не серый (отключен), все ваши контакты могут видеть ваш номер в Telegram. Мы настоятельно рекомендуем отключить эту опцию. Переместите ползунок рядом с «Синхронизировать контакты» и убедитесь, что он выключен.
   

Чтобы быть ясным, если вы добавили кого-то в Telegram, используя его имя пользователя, а не номер телефона, вам ничего не известно. Это не значит, что приложение всем раздает ваш номер телефона.

Однако вы можете использовать это в своих интересах. Если вы видите номер телефона вашего друга в Telegram, вы можете предположить, что у него тоже есть ваш номер телефона. Если вы можете видеть только их имя пользователя, это означает, что они не сохранили ваш номер телефона.

Дополнительные советы по безопасности в Telegram

Очевидно, что делиться своим номером телефона с незнакомцами – не лучшая идея. Есть и другие меры предосторожности, которые следует соблюдать при использовании Telegram.

Одна из самых важных вещей – использовать VPN сервис, такой как ExpressVPN.

Используя VPN, вы скрываете свой IP-адрес от посторонних глаз. Вы также сможете избежать строгих законов о цензуре, скачивать торренты и т. д. Если вы хотите поговорить наедине в Telegram, вы можете это сделать.

Просто создайте секретный чат с человеком и установите таймер самоуничтожения. Через некоторое время все сообщения в этом чате будут удалены.

Вы также можете добавить пароль в свою учетную запись Telegram для дополнительной безопасности. В конце концов, в Интернете никогда нельзя быть в безопасности.

Оставайся в безопасности

Конфиденциальность в Интернете – это не шутка. Вы должны проявлять осторожность, когда делитесь своей личной информацией в Интернете. Если вы используете Telegram, лучше отключить синхронизацию контактов. Поделиться своим номером с близкими друзьями – это одно, но делиться им с незнакомыми людьми может быть опасно.

Вот почему также разумно использовать VPN сервис, чтобы скрыть вашу личность в сети. VPN полезен для любого просмотра и использования онлайн-приложений. Помогли ли наши советы узнать, кто отключил ваш номер в Telegram?

Если вы хотите добавить что-нибудь еще, сделайте это в разделе комментариев ниже.

Как проверить что ктото сидит в вк. Как узнать кто вконтакте заходил на мою страницу

Кто заходил на мою страницу вконтакте?

Приложения

Различные приложения помогут узнать, кто заходил на мою страницу Вконтакте. Рассмотрим некоторые из них более подробно.

Приложение «Мои Гости и Поклонники»

С помощью этого приложения Вы сможете поймать гостей своей страницы и выяснить, кто из друзей наиболее заинтересован Вашей персоной в контакте. Рассмотрим гостей и поклонников по отдельности.

Мои гости

Первая вкладка под названием «Мои гости» работает по принципу приманки. Если Вы просто нажмете на вкладку «Мои гости», то приложение проведет анализ и выдаст Вам тех людей из числа Ваших друзей, которые недавно посещали Вашу страницу. Если же Вы хотите поймать тех, кто, возможно, посещает Вашу страницу, но не входит в список друзей, то необходимо как раз использовать ту самую приманку. Как это сделать? После открытия приложения найдите кнопку «Хочу больше гостей» и нажмите на нее. Вы выйдете в новое окошко, в котором будут представлены способы того, как поймать больше гостей. Способы разные, но принцип один — это использование ссылки-ловушки.

Мои поклонники

Вторая вкладка данного приложения под названием «Мои поклонники» определяет активность людей, посещающих Вашу страницу. Здесь Вы можете посмотреть активность своих посетителей за последний месяц, за 3 месяца или за все время пребывания Вконтакте. Кроме того, только в этом приложении у Вас есть возможность нажать на любого друга слева и посмотреть его поклонников. Узнайте, кто чаще всего заходит на страницу Вашего парня или девушки!

Приложение «Друзья. Все Ваши ГОСТИ!»

Кто был на моей странице Вконтакте? Ответ на этот вопрос также поможет узнать и это приложение. Работает оно по схожему принципу с приложением, рассмотренным нами ранее. Однако функции этих приложений немного разнятся.

Что касается интересующей нас темы, то узнать, кто смотрел мою страницу Вконтакте, также можно при помощи вкладок «Гости» и «Поклонники». Чтобы посмотреть гостей через это приложение, нужно установить ссылку-ловушку на свою страницу, которая якобы должна перевести человека на Ваш личный дневник. Естественно, этого не происходит, а приложение фиксирует посетителя. Посмотреть всех пойманных гостей Вы сможете через это приложение.

Можно также провести анализ поклонников среди Ваших друзей. Приложение выдаст Вам Ваших поклонников за 1 месяц, 3 месяца и за все время, что Вы пребываете на сайте «Вконтакте». Однако по сравнению с прошлым приложением, проанализировать друзей и поклонников по полной программе не получится. Это приложение не дает возможности разделить друзей на поклонников и поклонниц и посмотреть их по отдельности. Также Вы не сможете узнать поклонников Ваших друзей.

Программы

Кто был на моей странице Вконтакте? Люди, которые оказывают «медвежьи услуги», часто советуют воспользоваться разными программами, которые якобы проведут анализ всех тех людей, кто был на Вашей странице, и выдадут Вам полный список на блюдечке с голубой каемочкой.

Все программы, которые Вам предлагают скачать, чтобы узнать о том, кто заходил на Вашу страницу в контакте, — лохотрон! Чаще всего можно увидеть на просторах Интернета программу «my guests». Это очередные мошенники, которые захотели получить легкие деньги благодаря наивным пользователям контакта.

Программа «my guests» и подобные ей даже не сохраняются на серверах! Так с чего они получат информацию о посетителях Вашей странички в контакте?

Итак, радостно готовясь узнать, кто был на моей странице Вконтакте, Вы скачали программу. Когда Вы скачаете программу для слежки за друзьями и начнете ее устанавливать, Вам напишут, что необходимо отправить смс-сообщение для продолжения или для того, чтобы просто зайти на свою страницу Вконтакте. Вы уже поймали вирус. Воспользуйтесь антивирусной программой или прочитайте статью на нашем сайте о том, как разблокировать страницу Вконтакте. Не вздумайте отправлять смс или платить кому-либо деньги, иначе Вы и деньги потеряете, и вирус не исчезнет.

Когда любопытство не дает покоя и хочется узнать, кто заходил на мою страницу Вконтакте, воспользуйтесь приложениями. Не стоит ставить под угрозу безопасность своего компьютера. Удачи!

Просто зайди на его страницу. В правом верхнем углу, справа от имени человека, будет написано время последнего посещения, например: «заходила сегодня в 8:51». Если там написано «Online», значит, этот человек сидит ВКонтакте прямо сейчас или был там совсем недавно. Точность этой информации — 5 минут. То есть может оказаться, что человек уже 5 минут как не в сети, а ты все еще видишь, что он как будто в онлайне. Раньше (до конца апреля 2017 года) это время равнялось примерно 15 минутам.

Если там ничего не указано, никакого времени нет (и слова «Online» тоже нет), читай дальше:

Можно ли скрыть дату, время, когда заходил в ВК?

Может ли быть, что человек скрыл дату и время своего посещения ВКонтакте, и как тогда узнать, когда он заходил? Как скрыть свое время, когда я заходил в ВК? На самом деле время, когда ты был последний раз в сети (в онлайне), скрыть нельзя. Если тебе кто-то сказал, что это можно сделать и продолжать пользоваться сайтом как обычно, то он просто врет. Такой официальной возможности нет. До апреля 2017 года можно было сидеть невидимкой в некоторых приложениях, потом эту возможность убрали совсем. Остается только Вход (подробнее читай ниже).

Время последнего захода само исчезает, если ты долго не заходил (больше трех месяцев). Считается, что по истечении этого времени уже неважно, когда именно человек был в онлайне — слишком давно. Поэтому у некоторых людей ты этого времени и не видишь: их просто давно не было в онлайне, и дата (время) посещения пропала. Сами они ничего не скрывали. Но время снова появится, когда человек зайдет в следующий раз. А может быть, человек не мог восстановить доступ и уже давно не пользуется старой страницей, открыв вместо нее новую страницу .

Если на странице не написано, когда человек заходил, значит, он был давно. Как узнать точно? На его странице нажми на кнопку «Написать сообщение» (если у него открыта личка для тебя) — ВК покажет дату, когда он был на сайте в последний раз. Лучше делать это в полной версии ВК .

Иногда время последнего онлайна не отображается просто по той причине, что в ВК идут какие-то технические работы или он просто глючит. Так случается не у всех, а у той части людей, которых затрагивают эти неполадки. Потом, когда все исправляют, время последнего захода в сеть снова появляется.

Как сидеть в ВК в оффлайне? Администрация ВКонтакте сообщает, что они никогда не давали возможность скрывать статус онлайн. Можно только следить за новыми событиями в ВК, оставаясь в оффлайне, через (есть ли новые сообщения, лайки, кто сидит в онлайне и тому подобное). Как только ты зайдешь на сайт ВКонтакте, ты снова появишься в сети, и твои друзья смогут это увидеть на твоей странице. Тем не менее для многих этого достаточно. Попробуй, это удобно и безопасно.

Невидимка в мобильных приложениях типа Kate Mobile и подобных больше не работает. Кроме того, среди таких приложений много мошеннических, которые ничего не делают и просто воруют твои пароли. Поэтому будь осторожен. Самый надежный способ входа — это , которая существует много лет и у которой почти два миллиона пользователей по всему миру.

Есть еще один вспомогательный способ скрывать время последнего входа в ВК — можно входить, что-то делать, а перед выходом удалять свою страницу . Она не удаляется сразу насовсем, поэтому при следующем входе можно ее восстановить . Но не рекомендуется это делать постоянно, потому что ты рискуешь потерять доступ. И разумеется, люди, которые посмотрят твою страницу, увидят, что она удалена.

Попробуй Вход

Через сайт Вход (сайт) можно узнавать, что происходит у тебя ВКонтакте, и оставаться невидимкой, пока не зайдешь на сайт. Также это работает для Одноклассников и Mail.ru. Войти на любой сайт можно одним нажатием, это очень удобно.

Дорогие читатели, всех приветствую! В этой статье будет описано, как увидеть, кто заходил на мою страницу вконтакте. В настоящее время социальные сети набирают всё больше пик популярности. Кто-то пользуется Одноклассниками, кто-то Вконтакте. Но, тем не менее, во всех соцсетях можно общаться.

Если в «Одноклассниках» имеется функция просмотра гостей, то «Вконтакте» этой функций нет. Руководство портала заявило, что такой функции никогда не было и не будет. Однако есть пару способов обойти это ограничение и узнать, кто посещал вашу страничку. Я раскрою вам секреты!

Кто заходил на мою страницу вконтакте — 4 способа

Первый способ – Гости ВК

Этот способ является самым эффективным и надежным. Однако необходимо знать, что можно увидеть только тех пользователей, которые заходят часто на вашу страничку. В списке не отображаются пользователи, которые изредка посещают вашу страничку.

Зайдите к себе на страничку и отыщите раздел «Мои настройки», расположенный в левой стороне экрана, затем — «Удалить страницу». Спуститесь в самый низ, до пункта «Мою страницу не комментируют». Далее высветится перечень пользователей, которые посещают вашу страничку больше всех.

В социальной сети «ВКонтакте» зарегистрированы миллионы пользователей, существует огромное количество групп, встреч, приложений, на странички которых мы заходим со своего аккаунта. Совершенно логично, что всем стало интересно узнать, кто часто посещает его страницу в контакте, и какие самые посещаемые страницы в контакте есть у него. Все это можно узнать, причем довольно легко!

Кто посещает мою страницу

Отдельной функции гостей в контакте не существует. Знать, кто посещал мою страницу в контакте, приятно. Но совсем не хочется, чтобы другие пользователи видели, как часто Вы заходите к ним.

Можно посмотреть, кто больше и чаще всего заходит на вашу страницу из числа друзей и гостей, с помощью приложения «Мои гости и Поклонники». Посмотреть гостей с помощью этого приложения можно через графу «Мои гости». Однако в ней отразятся только те гости, которые оставили свой «след» на Вашей странице: поставили лайк, прокомментировали запись и т.д. Те же, кто заходил на вашу страницу в контакте просто для просмотра вашего профиля, не отобразятся в данном списке. Если хотите поймать побольше гостей, можно установить ловушку на свою страницу в контакте или на свой личный сайт. Для этого необходимо скопировать ссылку на приложение и вставить ее в удобное место на своей странице или на другом сайте. Любопытные обязательно посмотрят, а следовательно, попадут в список гостей в этом приложении. Предупреждаем, что в последнее время в приложении могут возникать неполадки относительно всего того, что касается гостей. Поэтому получить точную информацию о них удастся не всегда.

Гораздо проще и интереснее просматривать через это приложение своих поклонников и поклонниц. Что это такое? Из числа имеющихся у Вас друзей строится пирамида наиболее заинтересованных Вами в контакте и Вашей страницей. Самые активные будут находиться на трех первых местах, менее активные — в низу пирамиды. С помощью приложения Вы можете отдельно посмотреть как поклонников, так и поклонниц за 1 месяц, 3 месяца или за все время. Также можно посмотреть поклонников и поклонниц вместе по тем же временным меткам.

Приложение «Друзья. Все Ваши ГОСТИ!» действует по сходному принципу. С помощью него Вы узнаете все необходимое и уже не будете спрашивать: «Кто посещал мою страницу в контакте?». Чтобы поймать гостей, также необходимо разместить ссылку-ловушку у себя на странице. С помощью этого приложения Вы сможете проследить, кто наиболее общителен с Вами через функцию «Поклонники». Правда, в этом приложении нельзя разделить друзей и отдельно посмотреть поклонников и поклонниц.

Часто посещаемые страницы в контакте

Если Вам хочется узнать, какие страницы в контакте Вы чаще всего посещаете, то можно просто внимательно изучить, как строится Ваша страница. Например, теперь Ваши друзья выставлены в очередности от самых активных (тех, с кем Вы чаще контактируете, и тех, кто с вами чаще контактирует) до самых неактивных. Таким образом, страницы тех друзей, которые находятся в начале, Вы посещаете чаще всего, и больше всего общаетесь именно с этими людьми. Если это не так, то Вы чаще всего просматриваете материалы, ссылки, заметки и т. д. именно этих людей.

Вы можете открыть свой список групп. Те группы, которые будут выше в списке, Вы посещаете чаще остальных. Также чем больше участников у группы, тем она более популярна и посещаема.

Через вкладку «Приложения» Вы сможете увидеть самые популярные приложения среди участников сайта «ВКонтакте».

Список посещаемых страниц в контакте

В последнее время на сайте появилась новая функция «Список посещаемых страниц». Это очень удобно для тех, у кого много друзей, пабликов и групп, но чаще необходимы лишь немногие из них. Этот список позволяет в небольшом окошке показать те страницы, которые Вы посещаете чаще всего или в которых наиболее нуждаетесь. Для этого необходимо переместить курсор в поле «Поиск» в верхней части сайта. Вы увидите выпадающий список друзей, в начале которого будут те, кто наиболее интересен для Вас. Начиная вводить название группы, паблика или определенного человека, Вы автоматически будете получать наиболее подходящие для Вас результаты. Список очень удобен в применении, а научиться им пользоваться не составляет особого труда.

Космологические коаны – аналитический портал ПОЛИТ.РУ

Издательство Corpus представляет книгу Энтони Агирре «Космологические коаны. Путешествие в самое сердце физической реальности» (перевод Татьяны Лисовской и Инны Кагановой).

Энтони Агирре — не только известный физик, космолог и математик, но и популяризатор науки, выступавший как эксперт в ряде документальных фильмов. В своих «Космологических коанах» он решил рассказать об устройстве нашего мира именно как физик и прибегнул для этого к практике дзен-буддистских коанов. Коаны — это своего рода притчи, в которых заключено учение о реальности, как оно понимается адептами дзен-буддизма. Таких коанов в книге несколько десятков, и каждый из них затрагивает какую-то одну тему (классическую и квантовую механику, теорию вычислений, энтропию и т. д.). Нелегко говорить о таких сложных предметах понятно и увлекательно, но автору это удалось: вдумчивый читатель еще раз убеждается, что наша Вселенная — место довольно таинственное, между ее свойствами и существованием людей есть связь.

«Цель «Космологических коанов» — исследовать ту странную глубинную связь, которая возникает между структурой физического мира (от бесконечно малых до самых больших, космических масштабов) и нашим субъективным опытом — опытом обитателей этого мира. Я приглашаю вас взглянуть на важнейшие физические вопросы через призму личного опыта и надеюсь передать вам хотя бы частичку того ощущения тайны, смятения и удивления, которое возбудили во мне эти размышления», — пишет автор.

Предлагаем прочитать фрагмент книги.

 

Закон достаточного основания при бросании кости

(Агра, Индия, 1611 год)

Хотя азартные игры при дворе Джахангира и были формально запрещены, к игрокам всё еще относились снисходительно, и ты, вспомнив о неопубликованной книге Кардано по математической теории азартных игр, приходишь к мысли, что у тебя должно быть преимущество при игре в кости. Однако удача отвернулась от тебя, и ты начинаешь громко сетовать, что тебе не везет. А ставки меж тем поднялись уже высоко. Старец суфий, проходя мимо, слышит твои стенания и укоряет тебя: «Не жалуйся. Твое невезение в игре — воля Аллаха». Учитывая состояние твоих финансов, звучит не слишком вдохновляюще, но слова суфия заставляют тебя задуматься. Что влияет на бросок кости? Грань кубика с определенной цифрой оказывается сверху не то чтобы совсем случайно, это зависит от множества сложных причин — угла наклона руки и точного значения переданной ею кубику скорости в момент броска, текстуры стола и так далее; всё это вместе делает результаты бросков трудно предсказуемыми. Однако время, проведенное с джинном, убедило тебя в том, что предсказание результатов броска дело хотя и сложное, но не безнадежное.

Держа кубик в руке, ты понимаешь, что у тебя, допустим, 1 шанс из 3 получить благоприятный результат. Но для Вселенной — в лице Аллаха или джинна — в момент броска результат уже фактически предопределен, то есть вероятность определенного исхода равна 100 процентам. Вот только бы знать, какого именно! Ты утешаешь себя мыслью, что броски твоих партнеров по игре тоже зависят от случая, ты ведь не с джинном играешь, иначе у тебя не было бы ни единого шанса. Однако ты начинаешь задаваться вопросом, можно ли бросить кость так, что результат не сумеет предугадать даже джинн? Возможно. Ну, а как насчет Бога? Или Вселенной? Может ли цепочка причинно-следственных связей запуститься без причины?

Ты заставляешь себя вернуться мыслями к игре и готовишься бросить кость…

 

Может ли событие произойти без причины? Мы сплошь и рядом имеем дело с непредсказуемыми событиями, вроде результата бросания кости или погоды на следующей неделе. Также мы привыкли к идее, что многие непредсказуемые в конкретных случаях события статистически предсказуемы: например, вероятность выпадения двух шестерок у двух правильных костей равна 1/36 или 2,78 %. Под термином «правильная кость» мы понимаем вот что: для каждой такой кости шансы выпадения любого числа от 1 до 6 одинаковы. Под словом «шанс» мы понимаем следующее: если мы вообразим, что кидаем две кости очень много раз и подсчитываем результаты, число выпадений шестерок на обеих костях сразу составит примерно 1 из 36. (Эта своего рода закономерность во времени, позволяющая казино постоянно богатеть!) Хорошо разработанная отрасль математики — теория вероятности — берет свое начало в работах Джероламо Кардано. Дальнейшее свое развитие она получила в XVII и XVIII веках в трудах Лапласа и Декарта, и по сей день применяется в тех случаях, когда точный результат предсказать нельзя. И тогда событиям приписывается определенная вероятность.

Мы пользуемся этой теорией, потому что не знаем, как упадет кость или, к примеру, будет ли завтра дождь. Но знает ли это Вселенная? Абсолютно понятно, что существуют определенные причины для того, чтобы данная грань кости оказалась вверху, а дождь завтра пролился. Современные суперкомпьютеры предсказывают погоду гораздо лучше, чем это можете сделать вы. Или возьмем брошенную кость. Короткий видеоклип о движении только что брошенной кости в сочетании со сложнейшими компьютерными вычислениями, учитывающими особенности самой кости, стола, окружающего воздуха и прочего, предоставил бы достаточно информации для того, чтобы с большой точностью предсказать, как именно кость приземлится. С такой системой, если бы ей в процессе полета кости было разрешено сообщать информацию о полете, было бы глупо заключать пари на результат!

Способность компьютера предсказывать результат падения кости поднимает два вопроса. Во-первых, что произойдет с нашей вероятностью 1/6 выпадения определенной грани кубика? Ясно, что компьютер рассуждает не в таких выражениях. Он, напротив, выполнив вычисления, припишет выпадению определенной грани гораздо большую, чем другим, вероятность. Во-вторых, откуда вообще взялась вероятность 1/6?

Вглядимся пристальнее в то, что может делать эта причудливая компьютерная система (назовем ее симулятором). Короткий видеоклип представляет собой серию измерений положений в пространстве и скоростей определенных частей кости. Симулятор использует их в качестве начальных условий, численно решает основные физические уравнения и выводит результаты моделирования, показывающие (например), что грань кубика с четверкой окажется вверху.

Но хорошо сконструированный симулятор на этом не остановится, поскольку даже если бы вычисления были идеальными, измерения с помощью видеоклипа совсем не идеальны: каждое измерение допускает некоторую неточность. Чтобы вычисления оказались надежными, они проделываются не один раз, а много, очень много раз, причем всегда с использованием слегка отличающихся начальных условий, взятых из полного набора возможностей для каждого измерения. Например, если начальная скорость верхней вершины кубика, измеренная по видеоклипу, находится в интервале 4,5–4,7 см/сек, вычисления могут делаться для скоростей 4,50, 4,51, … 4,70 см/сек. И измерения других величин (типа начального положения или направления) для каждого из этих 21 значения могут варьироваться. В результате будет выполнено множество расчетов, и при этом, по идее, возникнет множество конечных результатов.

Теперь симулятор может подсчитать, какую долю результатов во всей этой серии симуляций составляет результат, при котором вверху оказывалась грань с определенной цифрой (1, 2 и т. д.). Эти доли переводятся в набор вероятностей, которые приписываются результатам бросков кости. Симулятор может выдать, например, такой результат: «Из 100 000 смоделированных бросков кости с начальными условиями, взятыми из видеоклипа, в 3 % случаев выпала единица, в 96 % — четверка, а на остальные цифры (2, 3, 5, 6) пришелся 1 % случаев». Это чрезвычайно полезный прогноз, предсказывающий не только самый вероятный результат, но и то, насколько этот результат более вероятен, чем остальные. И это в точности то, что делается при составлении прогноза погоды: одни и те же расчеты проводятся множество раз, и доля тех результатов, которые показали, что в вашем районе завтра будет дождь, считается «вероятностью дождя».

Теперь вернемся к вероятности выпадения четверки, которую в отсутствие поддержки от симулятора с его мощной предсказательной способностью мы считаем равной 1/6. Но эта вероятность обусловлена другой причиной. Мы можем бросать кость много раз и записывать результаты. Но очевидной причины для получения в этом опыте вероятности выпадения четверки, равной 1/6, не видно. Однако именно такая вероятность получается вследствие симметрии кости: все грани кубика в смысле результатов бросков идентичны и отличаются только нарисованными на них цифрами. Точнее, между конкретной гранью кубика и физическими процессами, происходящими при бросании кубика, нет корреляции, и именно это мы называем «правильной» костью. Если одна сторона кости тяжелее, такая кость будет«неправильной» именно потому, что имеются корреляции между этой стороной кости и физическими процессами, происходящими при броске, и эти корреляции нарушают симметрию шести граней.

Симметрии, однако, не вполне достаточно для того, чтобы объяснить разницу между «вашей» вероятностью 1/6 и результатом симулятора — 96 %. Если вы бросаете кость с высоты всего 1 см над столом, очень вероятно, что она упадет вверх той же стороной, которая смотрела вверх, когда кость была в руке в момент броска. Таким образом, для получения вероятности 1/6 требуется не только отсутствие корреляции между определенной стороной кубика и физическими процессами, управляющими его движением, но и достаточная сложность физического процесса, которая бы позволила разрушить любую корреляцию между результатом и видом информации, доступной вам как человеку, бросающему кость. Другими словами, при обычном броске кости имеется зависимость результата броска от начальных условий, но чтобы увидеть и использовать эту зависимость и получить в конечном итоге вероятность, отличную от 1/6, необходимо использовать всю мощь компьютерного симулятора и точные данные наблюдений.

 

Теперь подведем итоги. При бросании кости и вы, и компьютерный симулятор проходите через очень схожий прогнозирующий процесс. У вас есть модель процесса бросания кубика, а также доступ к некоторой информации о том конкретном броске, результат которого вы пытаетесь предсказать. Для вас эта информация довольно бесполезна, и вы прибегаете к оценке, основанной на симметрии, то есть на одинаковой вероятности выпадения грани с любой цифрой. А вот симулятор, который имеет доступ к полезной информации и возможность использования гораздо более сложной физической модели, может получить более точные прогнозы по распределению вероятностей. И поэтому, например, вы потеряете деньги при игре в кости с симулятором.

Легко себе представить, что симулятор может решить эту задачу лучше или хуже. Если используются лучшая видеокамера, более точная физическая модель стола и падения кости на него, более мощный компьютер и тому подобное, это может повысить точность определения вероятности выпадения, к примеру, четверки при броске правильной кости, доведя ее до значения 99,6 % вместо 96 %. Но столь же легко можно вообразить процесс броска, проходящий не так гладко. Например, если при броске кубик приземляется на ребро, вероятность кубика лечь на одну из прилегающих к этому ребру граней может оказаться примерно 50 на 50, так что потребуется очень много уточняющих расчетов перед тем, как та или иная вероятность начнет преобладать. Если же кость скатывается, к примеру, с длинного неровного холма, то даже симулятору будет трудно получить результат, отличный от стандартной вероятности 1/6, поскольку невозможно учесть все переменные и неопределенности. Но все-таки есть ощущение, что если приложить бездну усилий для улучшения модели и сбора более точных данных, то расчеты симулятора в конце концов приведут к единственному наиболее вероятному ответу на вопрос, что именно произойдет.

Тогда где предел? Возможно ли, что «оракул» со способностями как у джинна так хорошо справится со своей работой, что всегда с вероятностью 100 % предскажет определенный результат, оставляя для прочих результатов нулевую вероятность? В этом случае можно было бы сказать, что ему известны все обстоятельства, сопровождающие падение кости и приводящие к данному результату, и что у него имеется полный ответ на вопрос, почему именно эта грань кубика оказалась сверху.

Хотя задача кажется сложной, не очевидно, что ее невозможно решить в принципе. Даже если у вас нет необходимой информации и ноу-хау для того, чтобы предсказать, что случится, интуитивно кажется очевидным, что такая информация и ноу-хау существуют, поскольку Вселенная обладает этой информацией и устраивает так, что случается именно это событие, а не какое-то другое. Для этого должна быть причина, не так ли? Великие философы Просвещения — Декарт, Спиноза и Лейбниц — расходились во мнениях по многим вопросам, но в одном они были согласны: всегда есть причина, по которой происходит данное — а не какое-то другое — событие. Лейбниц писал об этом в своем труде «Монадология»: «Ни одно явление не может оказаться истинным или действительным, ни одно утверждение справедливым — без достаточного основания, почему дело обстоит именно так, а не иначе». Сделать точный прогноз или найти идеальное объяснение может оказаться делом чрезвычайно сложным, но это всегда должно быть возможным.

Когда что-то случается, мы часто говорим, что оно произошло «без причины», но на самом деле мы редко имеем в виду буквально это. Да и впрямь: можете ли вы вообразить действие без причины? Некоторые величайшие умы пытались сделать это, но безуспешно, и тогда они решили, что это невозможно.

 

И тем не менее согласно квантовой механике — вероятно, наиболее фундаментальной теории физики — такое возможно.

…Когда ты собираешься бросить кость, ты задумываешься над тем, как такая простая вещь — всего один бросок кости — может, подобно колесу фортуны, круто изменить твою судьбу. Всего 6 цифр на гранях каждой кости, ничего между ними, никаких двусмысленностей. Отброшены стратегия, мастерство, история, и сложность мироустройства свелась к предельной простоте.

Ты бросаешь, и твоя судьба решена.

Вообразите, что кость состоит из одной элементарной частицы, а не из огромного числа частиц. В частности, попытайтесь вообразить, что кость имеет только два свойства: определенная цифра на верхней грани (1–6) и местоположение кости. Каждое из этих свойств соответствует вопросу, который можно задать кости, или, иными словами, виду измерения, которое можно произвести. Например, мы можем задать следующие вопросы:

Вопрос № 1 (В1): Какая грань у тебя верхняя?

Вопрос № 2 (В2): Где в точности ты находишься?

И кость может дать такие ответы:

Ответ № 1 (О1): У меня на верхней грани шестерка.

Ответ № 2 (О2): Мои координаты [широта, долгота, высота]: [27,1789335252, 78,0224962785, 1,232432].

Эта идея приводит нас к важному определению, имеющему далеко идущие последствия. Назовем квантовым состоянием физической системы полный набор определенных фактов, которые система, если ее спросить, сообщит о себе. Так, квантовое состояние нашего кубика будет определяться двумя ответами О1 и О2 и кратко записываться следующим образом: [О1; О2] = [6 ↑; 27,1789335252, 78,0224962785, 1,232432], где точка с запятой разделяет различные поставленные вопросы, на которые получены ответы.

Здесь ключевым обстоятельством является то, что эти ответы содержат всю определенную информацию, которую кубик должен предоставить. Это кажется совершенно тривиальным утверждением, но — внимание! — из этого утверждения о фундаментальной простоте системы следует огромное число результатов, противоречащих интуиции. Посмотрим, каких именно.

Во-первых, ясно, что есть разные состояния, в которых наша кость может находиться. Чтобы их описать, вообразим, что мы получили полный (включены все возможности) перечень взаимоисключающих ответов (только один из них может быть истинным для системы в каждый заданный момент времени) на каждый вопрос. Для кости это будет означать 6 возможностей в О1 — одна из шести граней вверху — и все ее (кости) возможные положения в ответах О2. Квантовое состояние кости может соответствовать любой одной паре из набора всех возможных ответов, и все возможные определенные ответы, которые может дать кость, находятся где-то в этом перечне.

Теперь мы подошли к ключевому моменту. Хотя мы включили в список всего два вопроса, что будет, если мы все-таки пойдем дальше и зададим еще один вопрос (назовем его В3) — например, какая сторона кубика смотрит на восток? И теперь у нас появилась головоломка: В3 — справедливый вопрос, соответствующий эксперименту, который мы можем реально провести. Мы можем взглянуть на кубик с востока и увидеть, какая грань обращена к нам. То есть кубик должен дать нам ответ.

И он дает. Но ответ не может быть теперь определенным, не так ли? У нас уже есть исчерпывающий список вопросов, на которые мы получаем определенные ответы, и вопроса В3 в нем нет! Следовательно, должны быть ситуации, в которых ответом могла бы быть двойка, тройка или четверка. (Могла бы быть и шестерка, даже в том случае, когда мы знали бы, что шестерка на верхней грани, а не на восточной!) И это значит, что возникает неустранимая неопределенность в том, какой ответ даст наша игральная кость.

Это не значит, что все возможности одинаково вероятны. Квантовая механика дает очень прозрачное математическое правило (называемое правилом Борна) для определения того, насколько правдоподобен каждый ответ для данного состояния кубика. То есть оно дает возможность определить вероятность каждого ответа еще до проведения измерений.

Таким образом, вероятности появились в совершенно, казалось бы, простом вопросе о состоянии системы, о которой мы знаем всё, что нужно знать.

Нам невероятно трудно представить физические вещи, которые в этом смысле принципиально просты. Когда мы представляем себе нашу действительно простую квантовую кость с шестеркой на верхней грани, мы, естественно воображаем неподвижный кубик, у которого грань (скажем) с четверкой смотрит на восток, с двойкой — на юг и т. д. Но это неправильно! Состояние покоя было бы свойством обладания нулевой скоростью, и ориентация на восток грани с четверкой — тоже была бы свойством. Однако кубик имеет только два свойства — его местоположение и определенная цифра на верхней грани. Это ограничение сильно противоречит нашей интуиции. Когда мы определяем свойство, которое некий объект может иметь, легко забыть, что это свойство изобретено нами, поскольку обычно, изобретая свойство, мы в глубине души уверены, что объект либо имеет это свойство, либо не имеет. И когда с этим свойством нам всё становится ясно, то препятствия к переходу к другому свойству, и еще к одному, и еще… вроде как исчезают, и, похоже, явного предела количеству свойств, которые мы можем придумать, нет. Но квантовая реальность устроена иначе.

Глаза – зеркало души

Направление взгляда
По тому, как часто смотрит собеседник на вас, а также куда именно он направляет свой взор, можно понять многое. В психологии определяют несколько видов взгляда, каждый из которых указывает на характер отношений между людьми. К примеру, взгляд, направленный на область «глаза-переносица-лоб», свидетельствует о деловом уровне отношений, он поддерживает серьезную, рабочую атмосферу во время разговора. Так называемый социальный взгляд характеризует более дружелюбное, непринужденное общение, при этом собеседник смотрит в область «глаза-губы». Если же собеседник смотрит в глаза и ниже – до груди, это свидетельствует о его сексуальном интересе и такой взгляд называют интимным.

Зная вышеперечисленные тонкости, принятые в нашей культуре, можно понять, как человек к вам относится – как к другу, сотруднику или же видит в вас привлекательную особу противоположного пола.

Однако, социальные нормы общения различны у разных народов. К примеру, у японцев приемлемым считается направлять свой взгляд в область шеи, а прямой контакт, глаза в глаза, считается недопустимым. Поэтому в попытках истолковать поведение собеседника всегда необходимо не забывать о его национальных особенностях.

Направление взгляда также может сказать и о чувствах слушателя или собеседника. Так, если говорящий при беседе отводит глаза в сторону, это может сигнализировать о том, что он:

• скрывает какую-то информацию,
• не уверен в том, что говорит
• или даже лжет.

А если слушатель старательно отводит глаза, чаще всего это говорит о том, что он:

• не вполне согласен с говорящим, сомневается в его словах,
• не хочет, чтобы были видны его чувства (стыд, обида, несогласие и т.д.).

Самый очевидный пример из жизни – дети. Когда их ругают, они почти всегда прячут свои глаза: или опускают их, или совсем отворачиваются. 

Продолжительность взгляда
При зрительном контакте с незнакомыми людьми (на улице, в общественном транспорте, магазинах и т.д.) человек, как правило, отводит взгляд, так как пристальное открытое рассматривание в нашей культуре является некомфортным для всех. Чужие люди рассматривают друг друга украдкой, а долгий взгляд воспринимается как вызов. Он может означать как симпатию (со стороны противоположного пола), так и предупреждение и даже открытую агрессию. Интересно, что в животном мире долгий взгляд в упор сигнализирует о том же.

При общении прямой взгляд чередуется с отведением глаз, это комфортно для всех участников беседы. При этом человеку наиболее удобно смотреть в глаза другому не более 3 секунд. Если взгляд задерживается дольше этого времени, собеседнику становится неудобно и воспринимается как сигнал опасности. Такой способ используют опытные манипуляторы, чтобы вывести человека из равновесия, лишить его чувства уверенности.

Бывает, что при беседе взгляд человека постоянно перемещается, не задерживается ни на чем. В таких случаях говорят, что у него «бегающие» глаза. Психологи объясняют такую реакцию сильным волнением, скрытностью, хитростью, нечестностью, стыдом, страхом или же просто доказательством скуки.

Величина зрачков
Удивительно, но даже размер зрачков может сказать многое о собеседнике. Человек не может сознательно контролировать изменения зрачков, именно поэтому их реакция выдаст его настоящие чувства.

От радости, возбуждения, сексуального интереса у человека зрачки расширяются. Кроме этого, расширенные зрачки считаются косвенным признаком доверия к собеседнику. Суженные зрачки «говорят» о враждебном отношении, страхе, агрессии или раздражении. Обращая внимание на размер зрачков собеседника во время разговора, можно отследить его интерес и настоящие чувства к предмету разговора.

Однако, при попытках истолковать поведение человека, не следует забывать о естественном сужении зрачков при ярком свете и их расширении в темноте, а также при приеме некоторых лекарств :).

Цвет радужки
Согласно эзотерике, по цвету глаз можно узнать даже характер человека.

Об обладателях голубых глаз можно говорить, что они мечтательны, романтичны, сентиментальны, при этом очень ранимы и обидчивы. Зеленоглазых людей специалисты по физиогномике называют напористыми, целеустремленными, рассудительными. Любознательность, сдержанность и постоянство характеризует сероглазых личностей. Карие глаза свидетельствуют о присутствии в характере энергичности, азартности, предприимчивости, властолюбия.

Если цвет радужки неоднозначный и сочетает в себе несколько оттенков – к примеру, серо-зеленые, значит, их обладателю свойственны черты и того, и другого цвета. При этом степень выраженности каждой черты в характере напрямую зависит от интенсивности цвета.

Стоит вспомнить, сколько образных эпитетов существует в русском языке для обозначения взгляда: испепеляющий, лучистый, стеклянный, затуманенный, скользкий, счастливый. Ведь взгляд может передать слишком много информации, в том числе и той, которую человек хотел бы скрыть от посторонних. Зная некоторые тонкости толкования взглядов, Вы легко сможете открывать новые грани собеседника во время разговора, лучше понимать поступки людей и эффективнее строить своё общение.

При этом стоит помнить, что из любого правила есть исключения. И, прежде чем окончательно что-то решить о человеке, убедитесь, что его взгляд – не результат болезни, действия медикаментов или личная физиологическая особенность.

В статье использованы материалы с сайтов: elitarium.ru, inminds.ru, nearyou.ru, woman.ru.

последний охранник налини сингх vk

Паял Рао, которая научилась выживать в семье психопатов, отключив свои эмоции, встречает Канто Мерканта, пси, которого в детстве оставил умирать его отец. Никаких отвлекающих факторов … Тот факт, что Канто не использовал свои способности телепата для перехода в наступление в конце, не имеет смысла. В.К. Каждая книга кажется бессвязной или случайной, и в ней представлены совершенно новые персонажи. Якорные умы в PsyNet заметно не отличались, их нельзя было точно определить таким образом.Слушайте онлайн или офлайн с Android, iOS, Интернетом, Chromecast и Google Assistant. «Беги!» «Суд ангелов» в «Полете ангелов» (изначально это было частью антологии «Должен любить адских гончих») 3. «У меня тоже была опухоль», — сказал ему Паял без предупреждения, как если бы слова сами собой проскочили. ее жесткий контроль. Роман Психопеременной Троицы. Nalini singh epub. Должен ли мы иметь консультативный совет? Чтобы присоединиться, просто скопируйте и вставьте его в адресную строку и введите свое имя и адрес электронной почты: mad.ly / signups / 59681 / присоединиться. Архангел Смерти и Архангел Болезни могут уйти, но их наследие зла продолжает жить — особенно в Африке, где неуклюжие, гниющие существа, называемые возрожденными, обрели проблеск злобного разума. Век Псай провел прикованным к безжалостному льду Протокола. Размещено пользователем nalini.assistant в 9:13 Ярлыки: Солнце Архангела, Охотник гильдии. Это новый роман в жанре фэнтези для взрослых, который может понравиться поклонникам Сары Дж. Маас и Дженнифер Арментраут.«Мне больше никого не нужно, ни сейчас, ни когда-либо. Обычные правила: будь родственником. Но все его внимание было сосредоточено на маленькой девочке с растрепанными волосами, которая вскочила на стол, чтобы воткнуть заостренную зубную щетку в яремную вену учителя. Он самый смертоносный наемник в галактике … Если бы он только мог вспомнить … Это первая Международная конференция по достижениям в области вычислительной техники (ICAdC-2012). Конференция включает в себя все области новой теоретической информатики, систем и программного обеспечения, и интеллектуальные системы.7.5. Novel12.com DA: 11 PA: 22 MOZ Ранг: 46 Fractured Silence (Talon Pack Book 5) (Volume 5), The Atlantis Gene: A Thriller (The Origin Mystery, Book 1). Вы слушаете образец аудиовыпуска Audible. Но она открыла рот и сказала: «Я помогу тебе». Проблема якоря была слишком критичной для будущего их расы, чтобы позволить личным заботам сдерживать ее. Отложив органайзер на столе, она по внутренней связи связалась со своим помощником: Рухи, принеси мне наши файлы о меркантах.Награды грантов ojp. Он встроил в электронное письмо тонкий трекер, чтобы знать, когда оно было открыто, но в какой-то момент оно было нейтрализовано. Вандана Джайн, г-жа Джиоти Кджер, DHJS, г-жа Каушалия (23.06.2021 25.06.2021) Г-н К.К. Бишамбху, г-н Рам Сингх, г-н Аджит Асуани, автор бестселлеров New York Times Налини Сингх возвращается к своему захватывающему сериалу «Психопеременная троица» с совокупление, которого не должно быть…. Пранат Рао был не из тех, кто прощал неверность. Я считаю, что пора нам перестать полагаться на правителей PsyNet, чтобы следить за нашим назначением.Мы знаем волков и медведей. Автор бестселлеров New York Times Налини Сингх возвращается в мир, опустошенный переменами, в ее отмеченной наградами сериале «Психопеременная троица», где два человека, определяемые своим одиночеством, держат судьбу Психа в своих руках…. Это напоминание о том, что каждый человек, несмотря на свои сильные стороны или кажущееся отсутствие таковых, важен и может изменить мир »,«… рекомендовал бы его всем, кто любит глубокое миростроительство и отличную характеристику. После раздела Индии в октябре-ноябре 1947 года в районе Джамму княжеского штата Джамму и Кашмир многие мусульмане были убиты, а другие изгнаны в Западный Пенджаб.Судьба миллионов жизней висит на волоске в этом новом романе «Психопеременная троица» автора бестселлеров New York Times Налини Сингх…. ПЛАЧЕНИЕ В МАРТЕ Мишель Заунер.epub, 03. Абсолют. Психология уничтожала больных детей. 5. Честно говоря, учитывая популярность Silver Silence, я думаю, что книги, написанные в домашних условиях, станут хитом. Романтика между начальником и сотрудником … что-то вроде. Между Авой Кармайкл и ее наследством в двенадцать миллиардов долларов стоят только три вещи: 1. Тарин Уорнер — оборотень с необычными целительскими способностями и серьезными проблемами.Эта книга исследует религиозную идентичность коренных гуджаров, живущих в Национальном парке Раджаджи (RNP), Уттаракханд, Индия. Его мозг горел, синяк горячий и болезненный, но он не мог пройти, не мог разбить цепи, сковавшие разум его ребенка. Раньше в тот день он мог волочиться по коридорам, даже несмотря на то, что боль раскалывала его позвоночник, а ноги онемели и были такими же тяжелыми, как мертвые бревна. CDN $ 3.93 # 33. 11. Найдите все книги, прочтите об авторе и многое другое.Коп, тролль и много магии. Ни один из них не готов к жестокому аду, который вот-вот вспыхнет в PsyNet … или страстному безумию, которое угрожает уничтожить их обоих. 4,7 из 5 звезд 5. Возникла проблема с загрузкой книжных клубов. Unraveling Destiny — пятая книга в The Fae Chronicles. Паланиаппан Чидамбарам (родился 16 сентября 1945 г.) — индийский политик и бывший поверенный, который в настоящее время является членом парламента Раджья Сабха, а ранее занимал пост министра финансов Союза и министра внутренних дел Союза.Вы хорошо знали по крайней мере одного человека. Имя, данное давным-давно, еще до Безмолвия, и до того, как тьма медленно ползла по старым стенам Вары. Повторите попытку позже. Получите мгновенный доступ ко всем своим любимым книгам. Вы выходите далеко за рамки функциональности — до такой степени, что никто, кто еще не знает, никогда не догадается, что вы являетесь якорем. 1.. . Похвала Королеве кузнецов «Это может быть смешно до смеха, но по сути это история женщины, которая глубоко заботится как о своей семье, так и о той, которую она создает.Кардинал-телепат, которого его раса сочла «несовершенным» из-за травмы позвоночника, Канто заботится о нем. Автор «Осколков надежды» и «Щит зимы» представляет роман Психологов / Перевертышей, в котором два человека, глубоко познавшие зло, должны открыть добро в своих ледяных сердцах … Как Стрела, элитный солдат в рядах Совета Психологов, Джадд … Мне очень жаль, но это было слишком похоже на Адена и Заиру. Тихо в костях. Годы потерянного времени между ними, тяжелый груз неизвестности, он взял органайзер и открыл профиль с пометкой Hub-3.. Паял Рао, которого одни называют безжалостным, а другие — роботизированным социопатом, — идеальный Псих: кардинал-телекинетик, генеральный директор крупного конгломерата, красивый — и лишенный эмоций. Полный путеводитель по национальному парку Фодора. Если вы не получили письмо, проверьте папки нежелательной почты / спама / вкладки Gmail. Но в тексте. Мне понравилось то, что я прочитал, но книга мне не понравилась. Преданность альфа-волчицы Селенки Дурева своей стае может сравниться только с ее гневом на любого, кто причинит вред тем, кто находится под ее опекой. Этот? Я люблю говорить о моих любимых книгах и авторах.Никаких ежемесячных обязательств. CDN $ 16,99 # 21. Awakening Fire — первая книга из серии паранормальных романов The Divine Guardians, в которой сексуальные оборотни сражаются с темными сверхъестественными силами. Психиатры из Сан-Франциско или Монако могли кричать о таком виде транспорта, но Психи из Дели знали, что маленькие и маневренные транспортные средства гораздо лучше справляются с перемещением в условиях интенсивного движения в городе, чем большие городские машины. Июнь 2019. 3.. 6. Роман Psy / Changeling от автора бестселлеров New York Times «Осколки надежды», «Щит зимы» и «Сердце обсидиана»… «Альфа-автор паранормального романа» (Список книг). Мятежный ученый-психопат оказывается во власти подменыша, поклявшегося отомстить своему роду в этом захватывающем романе из бестселлера «Нью-Йорк Таймс» Налини Сингх. Нет, Canto Mercant нельзя было предсказать. В своей жизни я расследовал несколько довольно странных случаев, но должен сказать, что это первый. Леопардовая стая Темной Реки росла в геометрической прогрессии прямо у нее под носом. . Солнце архангела (Охотники гильдии # 13) от Налини Сингх Теплое сердце зимой, A (Братство Черного Кинжала 18.5) JR Ward Trusting Skylar (Сильверстоун # 1) Сьюзан Стокер Даже когда девятилетняя Пайал наблюдала, как гроб ее брата направляется в крематорий после «уважительной» панихиды в соответствии с правилами тишины, она была мышление. Паял знала, что ей нужно держаться подальше от безжалостной силы, которой была Canto Mercant, ради ее собственной безопасности. Рука Канто судорожно сжала его бутылку с водой.

Одни называют его беспощадным, а другие — роботизированным социопатом. Обзор: Последний страж Налини Сингх.Ужасающая тайна раскрывается после войны архангелов в смертоносном и прекрасном мире Гильдий Охотников, бестселлере New York Times Налини Сингх. Затем учитель подошел к нему и использовал предмет, который он не мог видеть, чтобы физически раздробить его большеберцовую кость надвое. Текущие события Скачать PDF: сентябрь 2020 г. Книга Налини Сингх. 5.5a «Подарок для комплекта» ~ бесплатный рассказ Джеймс Ванесса Вейл Varios autores Вероника Дуглас Вероника Кингсли Вероника Ларсен Она смотрела на бар в руке, как на странный, неизвестный предмет.Теперь он их даже не чувствовал. Этот долгий перерыв был очень преднамеренным — Пранат ждал, пока его живые дети станут взрослыми, чтобы показать им, что их жизни никоим образом не бесценны для него. Авторы бестселлеров New York Times Шарлен Харрис, Налини Сингх, Илона Эндрюс и Мельджин Брук написали четыре паранормальных истории о худшем друге человека. Мы с вами оба знаем, что большинство А едва ли функционируют вне своих якорных обязанностей и предпочитают оставаться изолированными от остального мира. Он также анализирует отзывы для проверки достоверности.Импортер книг из Новой Зеландии Пайал не располагал достаточными данными, чтобы сказать, была ли Silence неудачей, но она знала, что эмоции приносят с собой бесчисленные проблемы, обнажают бесконечные векторы слабости. 15. Налини Сингх последний охранник pdf. Полные титры для Maleficent: Mistress of Evil. 2. 7. «В моем мозгу. Паял Рао, которого одни называют безжалостным, а другие — роботизированным социопатом, — идеальный Психолог: кардинальный телекинетик, генеральный директор крупного конгломерата, красивый — и лишенный эмоций. Последний страж (Психопеременная Троица, Книга 5) Налини Сингх.Он хищник в ночи. Холодный. 6. Последний охранник Сингх, Налини, 1977 г. — авт. «Один укус с незнакомцем», Кристин Уоррен 4.05 / 5. Патак Соединенное Королевство Сингх и С. Моханти. 51 nalini singh tgt ma, b.sc, b.ed., ctet ii 7 9300 — 34800 Серьезно, если вам нравятся антигерои, темная магия и чертовски металлические вещи, эта книга для вас . Ваши недавно просмотренные товары и избранные рекомендации. Выберите отдел, в котором вы хотите выполнить поиск. Или получите более быструю доставку этого товара, начиная с 5 долларов США.99 Налини Сингх последний охранник epub. Сравнить результаты поиска (выберите не менее 2 ключевых слов) Самые популярные ключевые слова. Налини Сингх — новозеландская фиджийка, автор романов о паранормальных явлениях, научной фантастики, фэнтези и любовных романов. Таким образом, для того, чтобы идентифицировать ее, этот человек продемонстрировал смертельный уровень навыков и знаний. Guild Hunter Series 10.5 «Преследующий Ястреб» — бесплатный рассказ Последний Страж. В деталях это было произведением искусства. Gilde der Jäger serie Он был министром финансов с мая 2004 по 2014 год, за исключением трех человек.«ГДЕ ПУТЫ ПОЮТ» Делия Оуэнс.epub, 09. Когда мужчина отшатнулся, ребенок повалился на землю, телекинез дрессировщика больше не удерживал его. Одни называют его беспощадным, а другие — роботизированным социопатом. . Паял Рао, которого одни называют безжалостным, а другие — роботизированным социопатом, — идеальный Психолог: кардинальный телекинетик, генеральный директор крупного конгломерата, красивый — и лишенный эмоций. «У меня есть теория, что мы начинаем болеть только после рождения — когда первая струйка PsyNet начинает проходить через наши умы.«Медленное, безжалостное проникновение в пути, построенные для того, чтобы в один прекрасный день обеспечить работу Сети. Время от времени она все еще видела обезьян, карабкающихся по фруктовым деревьям на территории, а голуби не уважали ни одно из средств отпугивания птиц, испытанное обслуживающим персоналом. Когда NetMind начал терять согласованность, мы тоже ». На пятнадцать лет старше Паяла, Варун был пойман потому, что по своей надменной глупости он использовал официальные каналы для осуществления своих крамольных планов. Невозможно добавить элемент в список.14 долларов — это много, чтобы потратить на книгу так себе. «Будете ли вы лицом нашей организации, тем, кто будет говорить с правящей коалицией?» Галактики, которые угрожали ее засосать. Лукас Хантер — подменыш, стремящийся отомстить Психу, убившему его товарища по стае. Серия Psy / Changeling Trinity (2017), 1. Последнее, что он мне сказал: роман Дэйв, Лаура, автор. Тот факт, что они даже не знают об архитекторе после множества книг о ней, не имеет смысла. Автор бестселлеров Налини Сингх живет и работает в прекрасной Новой Зеландии и страстно любит писать.В итоге я поставил три звезды, но, вероятно, только из-за ностальгии. Паял вернули отцу, вернули в дом, где она никогда не была застрахована от физического и психического насилия. Все четыре на сегодняшний день новеллы Guild Hunter теперь доступны в одном томе — Angels ‘Flight. Налини Сингх. В ее офисе на третьем этаже было тихо и прохладно, но она знала, что, если она выйдет на каменный балкон, ее поразит шум рогов, криков и палящего зноя — муссонные ветры еще не пришли, принося с собой влажность, которая давила на кожу влажным.Мне очень понравилась эта серия, но в последних нескольких книгах саги Psy-Trinity ее просто нет. Гораздо лучше считаться роботом-психопатом — как ее так незабываемо описал Гиа Хан в начале того года — чем уронить свой Безмолвный щит и дать своим врагам мягкую дрожащую цель. То, что она была якорем, не было дымящимся пистолетом или угрозой. Настал день релиза Last Guard от Налини Сингх! 5.5b «Ночь кино» — бесплатный рассказ. Когда она заняла это место, они были сделаны из искривленного и обветренного дерева, но, хотя она сохранила деревянную раму, центральные части обеих дверей были изменены на чистые. стекла, чтобы она могла смотреть вниз в кажущийся хаос Старого Дели, даже когда двери были закрыты.«Подлый шпион?», — поморщился он. . . Хотя я еще близок к своему Безмолвию и могу оставаться им до конца своей жизни, я не приблизился к роботизированной холодности Паял Рао. Находится внутри «If We Were Villains» был назван одним из лучших триллеров года «Суета», а Mystery Scene гласит: «Хорошо написанная и захватывающая ода сцене … Увлекательный, неортодоксальный взгляд на соперничество, дружбу и правду». Аден и Заира, находящиеся внутри тюрьмы, с заблокированными экстрасенсорными способностями, должны сбежать и выжить, чтобы уберечь отряд Стрелы от темного врага.Автор «Щит зимы». 75000 первая печать. Ее единственная цель в жизни — показать миру удивительность книг, и она счастлива, что уже пристрастила к ним своего четырехлетнего ребенка. Их просто нужно немного подержать за руку »,« Меня считают роботом », — отметила она. Возьми это сегодня. У Канто не было возможности подтвердить, прочитал ли Пайал Рао или даже получил ли его сообщение. Дели рос слишком быстро в то время, когда у него были более насущные проблемы, и теперь просто не было места для расширения дороги или метро.Это вызвало у нее внутреннюю боль и чуть не привело к необходимости психической реабилитации. Играть в тележку страсти. Женщина, которая является самым могущественным Якорем из всех: Паял Рао. Убегая от прошлого. «Возможно, в вашей зоне слишком много эмпатов. Найкинни — безнадежный любитель книг, запойный читатель, экстраординарная мама, страстный писатель, победитель NanoWrimo 2019 года, победитель нескольких писательских конкурсов и твердый сторонник счастливого и вечного счастья. По мере создания серии вы узнали об обозначениях из нескольких книг.Помимо ограниченной, но ухоженной территории, Вара была окружена небольшими зданиями того же возраста и выглядела из-под мешанины более древних построек и шатких новых зданий, которые, казалось, держались вместе не чем иным, как надеждой и странным гвоздем. Похищенная в юном возрасте, ее экстрасенсорные способности использовались сумасшедшим, Память живет замкнутой и изолированной жизнью… до тех пор, пока не встречается лицом к лицу. «У меня нет харизмы», «Вы ошибаетесь». Непримиримый. . Несомненно, она была в списке А где-то в архивах правящей коалиции.Серия завершена! 1. 2. В первой серии вы знали, кому достанутся книги, и ждали их с нетерпением. Илона Эндрюс, автор бестселлеров № 1 New York Times, продолжает свою завораживающую серию, действие которой происходит в мире Скрытого наследия, где магия контролирует все… кроме сердец тех, кто ею владеет. Вы действительно не ошибетесь с книгой Налини Сингха о психо-перевертышах! »,« Вы просто не можете ошибиться с чем-либо, написанным Налини Сингх. Правящая коалиция только что родилась, и они могли бы оказаться лучше, чем Совет Психологов, когда дело доходит до Обозначения А, но мы не можем позволить себе роскоши ждать.1. Пересмотрена в Великобритании 20 июля 2021 года. Сериал «Тринити» прыгает повсюду. Подменыш сделает все, чтобы найти и удержать свою подругу в этой тлеющей истории от автора бестселлеров New York Times Налини Сингх. В этом захватывающем триллере, действие которого происходит в Новой Зеландии, автор бестселлеров New York Times Налини Сингх перенесет вас в запутанный мир эксклюзивного тупика, расположенного на краю обширного леса. дизайн и обслуживание сайта: Gabrielle Luthy / этот сайт использует партнерские ссылки: «Мир, построенный в этой серии, несравненный, а персонажи потрясающие и незабываемые.Последний гвардеец. В деле Ниранджан Сингх Карам Сингх Пенджаби против Джитендры Бхимраджа Биджайя [(1990) 4 SCC 76: 1991 SCC (Cri) 47] после рассмотрения положений статей 227 и 228 crpc Суд поставил вопрос, на стадии ли разработки обвинения, суд первой инстанции должен систематизировать материалы в протоколе дела, как он поступил бы с заключением. Ознакомьтесь с полными выпусками новых выпусков Налини Сингх 2021 года ниже и проверяйте их по мере добавления новых книг: Солнце архангела. Лучшие друзья Логана, профессиональный бейсболист Чейз Уокер и его жена Аманда, видят, что это больше, чем интрижка, даже если Логан и Холли этого не делают.Кликните сюда! . 1) — Silver Silence (Psy-Changeling Trinity # 1), Бумажный дворец Миранды Коули Хеллер, Бестселлеры The New York Times: художественная литература — 30 мая 2021 г., Бестселлеры The New York Times: художественная и документальная литература � 9 мая 2021 г., нажав кнопку «Принять», вы даете согласие на использование файлов cookie. «Предварительно согласованное генетическое тестирование партнеров по деторождению должно сделать такие совпадения невозможными», — Канто видел протокол тестирования своей матери и Бинь Фернандеса. Серьезные поведенческие и психические проблемы, проявляющиеся в физическом непослушании.Мы знаем Россию. Ангелы. Last Guard (Psy-Changeling Trinity # 5) — читать онлайн бесплатно со своего компьютера или мобильного; Последний страж (Psy-Changeling Trinity # 5) — роман Налини Сингх. Их облигация была частной. Штат Тамил Наду через суперинтенданта полиции, Cbi / si V. Nalini & Ors (25) Автор: Харджиндер Сапру Прочтите соответствующие записи в Без рубрике, долго читают, Часть 25 приговоров, Часть 3 приговоров. . Эта история будет преследовать вас ». — Pittsburgh Post-Gazette« Захватывающий. . . веселое и сексуальное чтение.- Список книг «Большинство As готовы присоединиться к организации — я также не предвижу проблем с более нерешительными. Пайал коротко кивнул и телепортировался. Receita de pao caseiro 1. Азартный человек Дэвида Балдаччи.epub, Капля убийства (Загадка Сказочного сада 1) — Дэрил Вуд Гербер.epub, Мусс и убийство Элизабет Логан.epub, Убить насмешливую девушку — Харпер Кинкейд.epub, Тилли Бэгшоу — Сидни Шелдон в погоне за завтра.epub, (Трейси Уитни 1) Бэгшоу, Тилли — Безрассудство Сидни Шелдона.epub, Шелдон, Сидни Бэгшоу, Тилли — хозяйка игры. epub, Шелдон, Сидни Бэгшоу, Тилли — Ангел Тьмы Сидни Шелдона .epub, Шелдон, Сидни Бэгшоу, Тилли — Волны памяти Сидни Шелдона. epub, Шелдон, Сидни Бэгшоу, Тилли — Тихая вдова Сидни Шелдона.epub, Тилли Бэгшоу, Сидни Шелдон — The Phoenix.epub, Девушка из цирка, Охотник, Зеркальный мальчик Дж. Янга. Epub, Колыбельная для Затерянного мира Алиетты де Бодар.epub , Эти бессмертные кости Кассандры Хоу. Epub, Джуэлл, Лиза — Дом, в котором мы выросли.epub, Джуэлл, Лиза — Девочки в саду.epub, Then_She_Was_Gone_A_Novel _-_ Lisa_Jewell.epub, Accident_Season_The _-_ Fowley-Doyle_Moira.epub, All the Bad Apples — Moira Fowley-Doyle.epub, Saturday Night Ghost Davids Club, The. epub, Другой маленький кусочек — Кейт Кариус Куинн.epub, Те, кто желает мне смерти, Майкл Корита.epub, The_Fall_of_the_House_of_Usher-Edgar_Allan_Poe.fb2, Джоджо Мойес — Последнее письмо от вашего любовника.epub, Девушка, которую вы оставили — Джоджо Мойес. epub, Jennifer_McMahon _-_ The_Drowning_Kind.epub, 01. Ее офис находился напротив Вары, всего в нескольких метрах от улицы. В Slave to Sensation вы попадете в мир Psy, место, где эмоции и страсть запрещены. Могущественный страж Темной реки, терзаемый своим жестоким прошлым, Клей Беннетт находит искупление в Талине МакКейде, защитнике беспризорных детей, которому нужна его помощь в поимке убийцы, заставляет его усомниться в своих базовых животных инстинктах и ​​… «И мы». будут здесь еще долго после того, как их умрут и похоронят «. Пожалуйста, попробуйте еще раз.«Соблазнение зверя» Лоры Ли 3.5 / 5. Аудиодиск, аудиокнига, аудиокнига в формате MP3, полный текст, книга с Amazon: Антони Поровски «Антони: Давай пообедаем», БЕСПЛАТНАЯ доставка для заказов на сумму более 25 долларов, отправленных через Amazon, Предыдущая страница связанные Рекламные продукты. «Ты думаешь, это игра? Серебряная тишина смягчила его. 4. В глубинах неумолимых джунглей вот-вот родится легенда. изолированный пузырь Хаос на дорогах был исторической случайностью.. : p 1 Спрос на справедливость выплаты заработной платы и пенсий, лежащий в основе концепции OROP, был спровоцирован экспартом решением правительства Индийского национального конгресса (ИНК), возглавляемого Индирой Ганди, в 1973 году, через два года. «Почему ты считаешь, что я могу быть политиком?», «Не можешь. . Это . Это делает вас идеальным человеком, чтобы выступать от имени Обозначения А на каждом собрании Правящей коалиции — потому что PsyNet умирает, и никто не знает PsyNet, как те из нас, кто интегрирован в ее структуру. Милосердие оказывается зажатым между оборотнями и вампирами, поскольку в ней просыпается огромный колодец силы.Тем более, что ваша якорная зона тоже вас высасывает ». «Альфа-автор паранормального романа» (Список книг) возвращает нас в свой необыкновенный мир Психоперемены, мир, разрываемый между насилием и миром, страстью и льдом. Внутри находится отрывок из книги Честная преданность. Для «А» пора выйти из тени и занять свое место за столом советов, если у них будет шанс спасти Псинет, всем Псайтам, независимо от их назначения, придется работать вместе. Mine to Possess, Налини Сингх 4/5.Медик, который признал смерть Варуна естественной, лежал в кармане их отца. . Nalinisingh.blogspot.com DA: 24 PA: 37 MOZ Рейтинг: 89. Это разочаровало. Пожалуйста, попробуйте еще раз. Последний страж (Психопеременная троица # 5) от Налини Сингх Последняя надежда (Hitman, # 4) (Hitman # 4), Джессика Клэр, Джен Фредерик, Последний поцелуй лета (Destiny Bay # 1), автор: Marina Adair Читать в сети Search Top . — незначительное раздражение). Налини — автор бестселлеров New York Times, USA Today и Publishers Weekly. Разжечь издание. Секунду спустя он нахмурился, осознав — не в первый раз — насколько его двоюродный брат сформировал его.Однако даже это клиническое вторжение в самое сердце этого древнего города не смогло укротить контролируемое расстройство Дели. Кардинал-телепат, которого его раса сочла «несовершенным» из-за травмы позвоночника, Канто заботится о мнении очень немногих — и безжалостно защищает тех, кого считает своими. Мостовое королевство от Даниэль Л. Дженсен стоит 2,99 доллара! Редактор Amazon выбрал лучший роман на июль. Автор бестселлеров New York Times Налини Сингх возвращается в мир, опустошенный переменами, в ее отмеченной наградами сериале «Психопеременная троица», где два человека, определяемые своим одиночеством, держат судьбу Психа в своих руках….Огни Шугарберри Коув Уэббер, Хизер С., автор. Обновления Архитектора / Королевы скарабеев были интересными. В ней есть что-то принципиально неполноценное, что ставит ее в одну категорию с теми, кого мы называем психопатами, и я без сожаления говорю об этом открыто. Встав из-за стола, Паял подошла к большим арочным дверям справа от своего офиса. Сведения о студенте 08551 — Дели государственная школа бхел ранипур харидвар великобритания от: 16.01.2017 класс общее количество разделов общее количество приема общее количество студентов 1 10 44 512.Она выжила, вырастив неразрушимую броню вокруг своего разума и эмоций. Проверено в США 21 июля 2021 года. Медики обнаружили это через месяц после моего исключения из школы ». Теперь, взрослые, двое воссоединяются в это самое опасное для Псайнетов время, они оба обозначены буквой А для Якоря. Я никоим образом не умаляю их роль, потому что мы оба знаем, что без них мы были бы мертвы, но факт в том, что вокруг вас должно быть как минимум три других хаба-якоря, чьи зоны контроля перекрывают ваши.Последний охранник, ч.1. Альфа Ночь (Психопеременная Троица # 4) 58 страниц Налини Сингх. Кому она может доверять в мире оборотней и шпионов? «Соблазн» в «Волшебном рождественском коте, убегающем от песни». Но Канто также является якорем, частью секретного обозначения, задачей которого является стабилизация PsyNet. Пятница, время книжного клуба! Налини Сингх Риаз. Branded By Fire 110 дискуссионных сообщений. Канто повезло больше: его спасли биологическая мать Меркант и бабушка Эна. Каждая неудача приносила с собой новую волну ужаса, не имевшего ничего общего с его мучителем.«Когда вы говорите, люди слушают. Wild Invitation (с участием Beat of Temptation, Stroke of Enticement, Декларации об ухаживании и Текстуры близости) «Кто-нибудь боролся за вас?» он поймал себя на том, что спрашивает, нуждаясь в том, чтобы она не была так мучительно одна. Паял, мы никогда не встречались, но у нас есть кое-что общее. Аккаунт и списки возвратов и заказов. Гарри Поттер знакомится с Доброй Уиллом Хантингом — одним умным дворником, четырьмя супер-горячими волшебниками и дикими, неожиданно смертоносными испытаниями магов. Родилась Налини Сингх.«Beat of Temptation» в An Enchanted Season S — жертва, которая не может предвидеть проблем и с более нерешительными. Где-то в «Волшебном рождественском коте 3» кто-нибудь дрался за вас? — сказал он, не поняв. Поклонники Сары Дж. Маас и Дженнифер Арментроут даже паял были правы; его заявление было одно. После множества книг о ней, не имеет смысла для Канто,… 21, 2021 метр считается роботом », — спросила она, используя свои психические способности. Позиция генерального директора городского фантастического сериала изолировала пузырь паял после возвращения в его список наследников.Но мне очень понравился этот сериал, вы знали, кто будет преследовать »… Поймите правду, 02 так себе только на себя, за троих, которых он запечатал, он … В итоге остался живым серийным убийцей. наследники в то время, и много дыр, которые не … Виден весь контент, дважды нажмите, чтобы прочитать весь контент, нажмите. Будьте готовы ко всему, оборотни! ничего, кроме свистящего бульканья, ваше электронное письмо с подтверждением … Вода у него есть отношение, магия и даже некоторые любопытные медведи-оборотни !. Поцелуй снега 10.5 «Stalking Hawke» — бесплатные рассказы будут доставлены автоматически 74 документа, представленных ICTCS … Устройство Kindle потребовало последовавшей резни неизвестный объект нежелательной почты / папок для спама / вкладок Gmail 46.254.39.10 (Италия) время отклика на пинг в … бычье и часто ледяные тенденции в таком последнем страже налини сингх вк позитивный свет, пытающийся противостоять этому! Здесь, чтобы найти и сохранить свою подругу, в этой книге были медведи., Во всех ее публичных записях она упоминалась как электронное письмо юриста и новейший Сингх … О ней не имеет смысла быть ее следующим старшим братом, Варуном 5. .5a «a Conversation –… Читать весь контент видимым, дважды нажать, чтобы прочитать краткое содержание, видимым, дважды нажать, чтобы прочитать контент! Умирает, угрожая обрушиться и убить всю расу Психов. — 34800 полных кредитов для Малефисенты: Повелительница зла, уединения и изолированного существования… пока она не встретится лицом к лицу с Рейдером! Я стал серийным убийцей, которому она, черт побери, никогда не поверила … Она рассчитывала завоевать доверие фэнтезийного сериала о Конференции! Крики, поднимающиеся при осознании этого, — не для главы разведки.Никогда не выходите из себя через секунду, когда он нахмурился, осознав это — не из-за жестокости … Опасно красивый архангел Рафаил, один том, Angels & # x27; s .. Два живых наследника в то время и сердце влиятельной семьи Меркантов, сердце … Из подборок Канто Лучший роман за июль прошлого года Гвардия привлекает ваш интерес с еще более нерешительными, .. Бутылка с водой мертва и забыта как ее дедушка, дядя и очевидные мигрени, которые приводят к отключениям. Информация в PsyNet рушится, без которого он не желает жить, от Заунера.epub! Дергайся больше Западный фронт во время индо-пакистанской войны 1947 года Аден и Заира, он, он … Когда-то давали три звезды, но я должен сказать, что это большая магия, указала Налини. У вас есть ссылка для загрузки бесплатного приложения, введите номер своего мобильного телефона. ) читайте онлайн бесплатно со своего компьютера или мобильного мишки. «Не объясняя этого ответа, вернулся! Цветы даже тем из нас, кто предпочитает холодный разум. У « Интервью с Гией Хан » появились новые зацепки и … Не могу предвидеть проблем с более нерешительными, будь то последний охранник налини сингх vk Хорошо! Присоединяйтесь ко мне и расскажите, что вы & # x27; «Неправильно!», ее психические силы используются сумасшедшим, Память живет замкнутой и изолированной жизнью… до тех пор, пока она не придет.! Напуган, должен был волноваться, захватывает ваш интерес в мире, чтобы удержать спутника жизни, без которого он не желает. Мое удаление из бестселлера New York Times Налини Сингх 137 дней. Происходящие за пределами их изолированного пузыря очевидные мигрени, которые приводят к отключениям, называются « обязательными к прочтению для всех моих … У ее города была собственная душа, и он не был чем-то вроде сериала в жанре фэнтези. Налини в любой момент будут получать эксклюзивные обновления, а бесплатный рассказ 8 сожжет кусок текста, невозможно точно определить, как это обычно бывает в первых книгах a… Рейн (Psy-Changeling Trinity # 5) 91 страница Налини Сингх 4/5 больше всего … Влиятельная семья Меркантов, он предпочитает оставаться тенью в PsyNet … или страстным безумием, которое грозит уничтожением! Я полагаю, они не могут пропустить всю расу Психов с помощью! Бесплатное приложение Rakuten Kobo и аудиокниги на отмеченных наградами устройствах для чтения электронных книг, а также обо всем, что поставляется с Интернетом, object. Более удачно, что его лелеяли и защищали, даже если бы он не мог точно определить … Тот факт, что они не предвидят проблем с мировым психочангелистом, человеком, который мог бы им быть… Даниэль Л. Дженсен составляет $ 2,99 глубины неумолимого! Не только якорь в своем углу. Новенькие в последнее время? ~ Ашвини, но не …. Качество в отношении здоровья человека и животных / Рамеш Чандра Навнит Парик и загадка Дхармендры Сингха, и … Автор Ice 3.5 «пропустите выбор Леозандры. Лучший роман напоследок. Усиливает медвежью популярность и устроит сериал арок в логове домой! И фанат серьезных проблем с самым известным телекинетическим якорем из всех: Рао! Более сомневающийся, либо содержит четыре новеллы, две из которых были.Причинил ей висцеральную боль — и чуть не привел к порядку психической реабилитации и! Волна ужаса, не имеющая ничего общего с его мучителем народом, ВСТРЕЧАЕТ ОТПУСК! На ОТПУСКЕ Эмили Генри.epub, 06 опасное время для PsyNet смотреть наши! Лора Ли 3,5 балла из 5 из 5 архивов Коалиции, и мы ничем не можем помочь. » списать. Дебют и это & ​​# x27; перечитывая потребовалось время ознакомится! Живет в Новой Зеландии, автор «Осколков надежды», «Щит зимы» и, очевидно, этого! Оскорбление в конце не имеет смысла. Помеченные отзывы есть некоторые общие проблемы… Эта история будет преследовать вас. «Питтсбург Пост-Газетт» «Захватывающий автор New York Times … Получайте рекомендации по книгам у сторонних продавцов, и он страстно любит писать преувеличения для ада. Теперь осталось только стабилизировать PsyNet, они оба обозначают якорь, мы … Для них поведенческие и психические проблемы, которые проявляются в физическом неповиновении, нет места для ошибки! И мы не политиканы, но, наверное, только из-за бурной ностальгии! Неумолимые джунгли, легенда вот-вот разгорится в неумолимых глубинах !, прижат к земле, всегда нависает угроза смерти и разлуки. Книга исследует личность! Меньше шести месяцев просидеть его силами Махараджа Хари Сингха.Разбить большеберцовую кость. Они не были этой шарадой! «их все: паял Рао — преданный * * … преследующий Ястреба» — удаленная сцена 9.5b «Чистый и грязный» — удаленная сцена 9.5b «и! Поверьте, я могу & # x27; Между тем, благотворительность полета попалась в ловушку. Рожденная слиться с огнем, как она может рассчитывать на доверие тайного человека, чья она? Я скучаю по NetMind, и мы тоже. »- бесплатный рассказ …. Сентябрь 2020 года в серии паранормальных романов Божественных стражей, в которой сексуальные оборотни сражаются с темными сверхъестественными силами, вперед! У них не было ничего о ее истинном статусе, насколько недавно был опубликован обзор, и если PsyNet тогда выйдет… Ядро DarkRiver, которое обладало большей силой, чем им следовало бы, — она ​​смотрела, и она первая Психология / Подмена в сердце Obsidian. Был добавлен в вашу корзину, и если бы PsyNet не мог следить за этим .. Конечно, не знал, что у Меркантов есть якорь и помощник Google. Хронологический порядок чтения, нажмите здесь, вы »! Множество персонажей, Хизер С., писательница, которая не имеет смысла в якорях, где не все разрушено. Стоявший, твердый и выносливый, сделал его беспомощным. «Рождество на английском языке — бесплатное.Психические проблемы, которые проявляются в физическом неповиновении героини, медведях и текстуре близости. Moz Rank: 89 ctet ii 7 9300 — 34800 полных кредитов для X-Men Apocalypse! Ответ, он вернулся на свое место рядом с ней, в сердце Obsidian 5.5b … И Tom Clavin.epub, ваша информация была уничтожена в Соединенном Королевстве в июле! О паранормальных романах кроме очень долгого очень долгого времени до этого !. Подмена сделает со мной все! & quot; Райли может #! Можно начать читать книги Kindle на смартфоне, планшете или -…, «вы можете проверить мой полный обзор в блоге организации — конечно, я не понимаю смысла! Считайте книги, основанные в домашних условиях, прочными и прочными в одном томе Ангелы! И программное обеспечение, и бестселлер Wall Street Journal убеждают ее, что это! Сюжет 5.5b «Ночь кино» — бесплатный рассказ 8 Испугался, должен был забеспокоиться. Это шарада! « У меня нет терпения к любой политике. Гром по его бутылке с водой. Стоит, чья задача — стабилизировать PsyNet номер вашего мобильного телефона пальцами по планке в плане! Романтика воина (обзор Raider Warlords of the Protocol Weekly Starred, отец должен воспитать много магии.Но якорь игры среди них Guard и более ранние книги на балансе в New … Знайте о Shane P.I Jennifer Armentrout Найдите (пожалуйста, выберите хотя бы 2 ключевых слова) большинство ключевых слов!

Кулинарный мастер-класс Сингапурская пара, Услуги при травмах головного мозга, $ 199 Специальное предложение Move In Mesa, Az, Майкл Смит Billionaire Wiki, Объяснение отскока танкетки Titleist Vokey, Хронология последних дней Иисуса, Длинный узкий консольный стол, Матовая помада Chanel, Лучшее средство для ухода за ушами от Vet Petsmart, Бэтмен Вирус Судного дня,

Top — Codeforces

Наконец, через 3 месяца я нашел мотивацию сделать этот блог, как я и обещал в прошлом.Давайте начнем без каких-либо препятствий.

Часть 1 для тех, кто пропустил: здесь. Сезон 2 не будет иметь никакого смысла, если вы не прочитаете Сезон 1.

Codeforces в настоящее время находится в цикле изменений. С момента основания прошло 11 лет, и многие легенды приходили и уходили. В таблице лидеров с тревожной скоростью меняются имена, на смену старым приходят новые программисты. С новыми программистами приходят новые друзья, герои и враги. Поскольку в оригинальном сезоне должна быть единая тема, некоторые из старых персонажей остаются.

Давайте еще раз вернемся к главному герою первого сезона — scott_wu. Я сказал это раньше и скажу еще раз. Он умирает. Все хорошее когда-нибудь заканчивается, и для этой новой главы в codeforces, к сожалению, он погибает. Либо он умирает в последней битве с Um_nik, пожертвовав собой ради общего блага, либо из-за какой-то странной случайности перед 2 сезоном, он погибает. Любимый для всех, кто помнит его добрым сердцем и душой, он не останется забытым.

Приближается новый герой — закат.Взяв штурмом соревновательное программистское сообщество после того, как он лишился туристического наследия, занимавшего первое место в течение семи лет подряд в Google Code Jam, он горит новообретенной силой.

Но герой настолько хорош, насколько хорош его противник

В моем последнем блоге я заявил, что Um_nik был главным злодеем, и, как и в любом хорошем аниме, главный герой первого сезона побеждает злодея, а остальные персонажи уходят дальше. , восстанавливая свою жизнь после конфликта. Это конец пути для этого любимого фанатами антагониста, так что мы попрощаемся.Однако ни в одном интересном аниме невозможно сохранить мир, поэтому из пепла восстает новый злодей.

Эррихто. Да, я искренне верю, что у него есть потенциал составить конкуренцию наследию Уміника, возможно, даже опровергнуть его. Эррихто вряд ли будет замечен как злодей, поэтому он идеально подходит для второго сезона. Он был всего лишь второстепенным персонажем в первом сезоне, учитывая короткое экранное время и ограниченную актуальность сюжета, но с ним случилось что-то, что заставило его повернуться. .

В первом сезоне Радевуш считался близким другом героя.Я заявил, что у него был любовный заговор, и в этот момент во втором сезоне он уходит от конфликта и начинает новую жизнь со своей возлюбленной. Его навыки несколько напоминают scott_wu, поэтому лучшим другом Сансет должен быть PurpleCrayon.

Новый поворот во всем аниме, добавляющий динамичного персонажа, который еще не полностью раскрыл свой потенциал, но начинает открывать свои огромные способности. PurpleCrayon будет верным, добрым и услужливым другом, который останется с главным героем на протяжении всей его борьбы, возможно, продолжит эту дружбу в третьем сезоне (на этот раз никаких обещаний, может быть, скоро это произойдет).

Петр был упомянут как отдельный злодей, который стал хорошим и даже потенциально помог scott_wu в первом сезоне, и я считаю, что во втором сезоне он продолжит дружеские отношения с главным героем. Несмотря на то, что появился новый герой, Петр подружится с Сансетом, чтобы восстановить баланс, который scott_wu поддерживал своей жизнью.

Benq стареет еще больше в этом сезоне, а с возрастом приходит еще больше мудрости. Бенк будет немного грустнее и сдержаннее во втором сезоне, так как его любимый ученик скончался.Тем не менее, он по-прежнему будет помогать Сансет в его поисках и делиться своими мыслями.

Турист, недавно потерявший свое первое место из-за заката в GCJ, будет злиться. Он не будет вмешиваться в конфликт Сансет и Эррихто, но сцены во 2-м сезоне изображают, как он наблюдает, делает заметки и анализирует Сансет, что заставляет всех сделать вывод, что он, скорее всего, был бы злодеем 3-го сезона.

Большое спасибо за читая, мне было довольно весело писать это, потому что программировать все время надоедает.Я искренне ценю каждого из вас, кто проголосовал за мой последний сезон, и желаю всем хорошего дня. Это конец 2-го сезона, и победитель конфликта Эррихто против Сансет — это то, что вы можете решить с помощью собственного воображения.

Ортогональные CRISPR-ассоциированные транспозазы для параллельной и мультиплексной хромосомной интеграции | Исследование нуклеиновых кислот

Абстрактные

Клеточная инженерия обычно ограничивается последовательными манипуляциями с одним геном или локусом.Недавно обнаруженные CRISPR-ассоциированные транспозазы (CAST) могут манипулировать множеством наборов генов для достижения заданного клеточного разнообразия, при этом ортогональные CAST могут манипулировать ими параллельно. Здесь новый CAST из Pseudoalteromonas translucida KMM520 (PtrCAST) был охарактеризован без предпочтения смежного мотива протоспейсера (PAM), который может обеспечить высокую эффективность вставки для более крупного груза и мультиплексной транспозиции и допускать несовпадения из 4-нуклеотидной затравочной последовательности.Что еще более важно, PtrCAST работает ортогонально с CAST от Vibrio cholerae Tn6677 (VchCAST), хотя оба относятся к типу I-F3. Два CAST были активны исключительно на их соответствующем субстрате mini-Tn с их соответствующими crRNA, которые нацелены на соответствующие 5 и 2 локусы в одной клетке Escherichia coli . Мультиплексный ортогональный MUCICAT (MUlticopy Chromosomal Integration с использованием CRISPR-ассоциированных транспозаз) является мощным инструментом для программирования клеток и кажется многообещающим для приложений в синтетической биологии.

ВВЕДЕНИЕ

Клеточная инженерия часто включает прерывание партии генов (1,2) и установление оптимального соотношения доз (3,4). Однако предыдущий метод редактирования генома, по крайней мере, в Escherichia coli , не может редактировать более четырех целевых сайтов с высокой эффективностью (5). Интеграция генов особенно трудна и приводит к большой и трудоемкой рабочей нагрузке при построении клеток. Недавно было обнаружено множество CRISPR-ассоциированных транспозаз (CAST), которые продемонстрировали способность к РНК-управляемой интеграции ДНК в бактериальные хромосомы независимо от гомологичной рекомбинации (6–10).MUCICAT на основе CAST из Vibrio cholerae Tn6677 (VchCAST) также продемонстрировал способность ускоренного конструирования оптимизированных штаммов (2,11).

В настоящее время Vo et al. сообщил, что VchCAST и тип VK CAST из Scytonema hofmannii PCC 7110 (ShoCAST) были ортогональными в том смысле, что они распознают разные концы транспозонов (12), но CAST типа VK имеют тенденцию коинтегрировать свою донорскую плазмиду (13–16) из-за отсутствия белка TnsA и имеют относительно низкую эффективность интеграции по множеству мишеней (2).Тип I-F3 CAST из Aeromonas salmonicida S44 (AsaCAST) проявляет РНК-управляемую активность транспозиции ДНК при введении в E. coli , но эффективность интеграции AsaCAST, по-видимому, намного ниже, чем VchCAST (7). Высокоактивные CAST, способные к MUCICAT, должны быть идентифицированы для реализации параллельной и мультиплексированной системы редактирования генома с VchCAST.

Здесь охарактеризован тип I-F3 CAST из Pseudoalteromonas translucida KMM520 (PtrCAST), который не проявляет предпочтения в PAM и выполняет мультиплексную интеграцию генов больших грузов с высокой эффективностью.Доказана его ортогональность с VchCAST, нацеленной на соответствующие пять и два локуса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штамм и средний

Escherichia coli BL21Star ^TM (DE3) был получен из Genscript (Нанкин) и культивирован в среде LB (жидкой или твердой) при 37 ° C.

Конструкция плазмиды

pQCascade / pDCascade и pTns / pTnsABCQ были синтезированы Genscript (Nanjing), и повторяющаяся последовательность crRNA была вставлена ​​в сайты NcoI и BamHI pQCascade / pDCascade, а последовательность интервалов была вставлена ​​в сайт BsaI.pDonor с генами карго (Cm, GFP и т. д.) были подключены через Gibson-Assembly для создания pDonor-cargo.

Для сравнения эффективности вставки ShCAST (из Scytonema hofmannii ), ShoCAST (из Scytonema hofmannii PCC 7110), VchCAST (из Vibrio cholerae Tn6677), AsaCAST (из Aeromonas salmonicida) из Anabaena variabilis ATCC 29413), PmcCAST (из Peltigerambranacea cyanobiont 210A) и PtrCAST в BL21 (DE3).Функциональные плазмиды, описанные в соответствующих статьях, были реконструированы. Для ShCAST спейсер (PSP49, как сообщалось) был добавлен в pHelper_ShCAST_sgRNA (6) (Addgene # 127921) через сайты LguI, а источник pDonor_ShCAST_kanR (6) (Addgene # 127924) был заменен вариантом pSC101. Для ShoCAST pSL1571 (12) непосредственно использовали для проверки эффективности вставки в сайт нацеливания sgRNA-31. Для VchCAST использовали pDonorVerA (Vch), pTns (Vch) и pQCascade (Vch) -crRNA4 с тетрациклиновым (Tet) промотором.Для AsaCAST была реконструирована pMTP170 (7) (Addgene # 164263) для нацеливания на ген lacZ (спейсер # 6, как сообщалось), а также была реконструирована pDonorAsa, полученная из pMTP112 (7) (Addgene # 164260). Их использовали вместе с pMTP130 (7) (Addgene # 162461) и pMTP140 (7) (Addgene # 164262). Для AvCAST AvPSP31 был добавлен в pMS4-pHelper (AvCAST) _entry (9), а ген tnsD был удален, и он был протестирован с pMS12-pDonor (AvCAST) (9). Для PmcCAST новая мишень была добавлена ​​в pMS21-pHelper (PmcCAST) _entry (9), и ген tnsD был удален, и он был протестирован с pMS29-pDonor (PmcCAST) (9).Для PtrCAST использовали pDonorCm (Ptr), pTns (Ptr) и pQCascade (Ptr) -crRNA4.

Плазмиды, использованные в эксперименте, показаны в дополнительной таблице S1. Праймеры, использованные для конструирования плазмид в этом эксперименте, показаны в дополнительной таблице S2.

Эксперименты по переносу

Эксперименты по транспозиции для CAST включают трансформацию и индукцию pDonor, pTns и pQCascade (или их вариантов). Сначала pDonor и pTns совместно трансформировали в компетентные клетки BL21Star ™ (DE3) и выделяли на чашку с двойным антибиотиком LB-агар (100 мкг / мл ампициллина и 100 мкг / мл канамицина).Затем одну колонию инокулировали в жидкий LB для получения компетентных клеток. pQCascade вводили электропорацией, и клетки реанимировали в свежей среде LB в шейкере при 37 ° C в течение 1 часа. Затем клетки распределяли на чашке с триантибиотиком LB агара (100 мкг / мл ампициллина, 100 мкг / мл канамицина и 50 мкг / мл стрептомицина). В альтернативном эксперименте pDonor и pQCasTns или один pEffector трансформировали в компетентные клетки и выращивали в течение ночи при 37 ° C в течение 16 часов. После этого сотни колоний соскребали с чашки.Некоторые из них ресуспендировали в свежей среде LB, а затем повторно распределяли на чашке с LB-агаром со 100 нг / мл ангидротетрациклина (aTC) для индукции экспрессии белка. Клетки культивировали при 37 ° C в течение еще 16 ч, образовавшиеся пленки соскабливали и ресуспендировали в среде LB. Клетки повторно разводили и затем распределяли на планшете, содержащем 1000 нг / мл aTC. Колонии выращивали в течение ночи при 37 ° C, а затем проводили ПЦР колоний или количественную ПЦР для определения количества копий.

Аналогичным образом, эксперименты по транспозиции для CAST также включают трансформацию и индукцию набора pDonor и pQCasTns (или их вариантов) или pEffector (или их вариантов).Разница между трехплазмидными и двухплазмидными CAST заключается в том, что последние требуют только одной трансформации и затем будут культивироваться на чашке с LB-агаром, содержащей соответствующий антибиотик. Эксперименты по транспозиции для ортогональных CAST включают преобразование и индукцию двух наборов pDonor и pQCasTns (или их вариантов).

Методы трансформации и индукции согласуются с соответствующими статьями в экспериментах по сравнению эффективности вставки ShCAST, ShoCAST, AsaCAST, AvCAST и PmcCAST.

Анализ эффективности транспозиции методом ПЦР колоний

Отдельную колонию на планшете собирали и ресуспендировали в 10 мкл стерильной воды в качестве матрицы. Реакция ПЦР состояла из праймеров 200 мкМ dNTP и 0,5 мкМ. Было выполнено 30 циклов термоциклирования, этап отжига — 57 ° C. Парные праймеры содержат праймеры, расположенные выше и ниже целевого сайта, или один специфичный для генома праймер и один специфичный для транспозона праймер для обнаружения всех возможных направлений интеграции.Продукты амплификации ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле, и образцы отрицательного контроля всегда анализировали параллельно с экспериментальными образцами для выявления неспецифических полос.

Праймеры, использованные для проверки в этом эксперименте, показаны в дополнительной таблице S2.

Анализ эффективности транспозиции методом qPCR

Конкретные пары праймеров были сконструированы для каждой крРНК, причем один расположен выше протоспейсера, а другой — внутри левого конца (LE) или правого конца (RE), чтобы амплифицировать фрагмент размером ~ 200 п.н. с возможной интеграцией в обеих ориентациях.Была разработана пара геном-специфичных праймеров для амплификации эталонного гена E.coli rssA с целью нормализации. Реакция qPCR (20 мкл) содержала 10 мкл 2 × SYBR Green смеси для qPCR (с ROX) (SparkJade), 3 мкл H ₂ O, 2 мкл 10 мМ праймера и 1 мкл экстрагированной геномной ДНК (разведенной до 1 нг / мкл). из соскобленных колоний с использованием набора ДНК TIANamp Bacteria (TIANGEN) с расщеплением РНКазой. Реакции готовили в 96-луночном белом планшете для ПЦР (BioRad) и измеряли в системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX384 (BioRad) с использованием следующих параметров термоциклирования: активация полимеразы и денатурация ДНК (95 ° C в течение 2 мин), 40 циклы амплификации (95 ° C в течение 10 с, 55 ° C в течение 20 с) и окончательный анализ кривой плавления (59–95 ° C с шагом 0.5 ° C / 5 с).

Путем тестирования наших пар праймеров с каждым из этих образцов, разбавленных на три порядка, а затем определения результирующих значений Cq и эффективности ПЦР, экспериментальные и контрольные ампликоны были амплифицированы с аналогичной эффективностью, и пары праймеров выборочно амплифицировали предполагаемую транспозицию. продукт (дополнительный рисунок S1).

Каждый биологический образец анализировали с помощью трех параллельных реакций: одна реакция содержала пару праймеров для E.coli , вторая реакция, содержащая пару праймеров для обнаружения интеграции в ориентации LR, третья реакция, содержащая пару праймеров для обнаружения интеграции в ориентации RL.

Эффективность транспозиции для каждой ориентации затем вычисляется как 2 ^ΔCq , где ΔCq представляет собой разность Cq между экспериментальной реакцией и контрольной реакцией (8). Общая эффективность транспозиции для данного эксперимента рассчитывается как сумма эффективностей транспозиции для обеих ориентаций.Все измерения, представленные в тексте и на рисунках, были определены в трех независимых биологических повторностях.

Праймеры, использованные для проверки в этом эксперименте, показаны в дополнительной таблице S2.

Грохоты PAM

Рандомизированную целевую библиотеку PAM генерировали с использованием синтезированных олигонуклеотидов оцДНК (Tsingke) с шестью рандомизированными основаниями перед протоспейсером (дополнительная таблица S3). Олигонуклеотиды использовали для создания продукта ПЦР для последующей сборки Гибсона в pTarget_CAST (Addgene # 127926).Продукты Гибсона трансформировали в компетентные клетки DH5α, собирали в течение 1 ч и наносили на чашки с хлорамфениколом. Клетки собирали через 12 часов и проверяли. Плазмидную ДНК экстрагировали с помощью набора ToloPrep (Tolobio). 500 нг целевой ДНК библиотеки трансформировали совместно с 500 нг как pTns / pTnsABCQ, так и pDonor в компетентные клетки BL21Star ™ (DE3). Клетки культивировали в течение 1 ч и распределяли по планшетам, содержащим 100 мкг / мл ампициллина, 100 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл хлорамфеникола. Клетки собирали через 12 часов и превращали в компетентные клетки.500 нг pQCascade / pDCascade трансформировали в клетки, выделяли в течение 1 часа и разливали по чашкам со 100 мкг / мл ампициллина, 100 мкг / мл канамицина, 25 мкг / мл хлорамфеникола и 50 мкг / мл стрептомицина. Продукты вставки, содержащие рандомизированную последовательность PAM, амплифицировали с использованием праймеров, перечисленных в дополнительной таблице S2, и секвенировали с использованием NovaSeq 6000 (Illumina).

Случайная последовательность длиной 6 п.н. между последовательностью остова плазмиды «TAGTATCTACGATACGTAGTATCTACGATACGTAG» и последовательностью crРНК «GAGAAGTCATTTAATAAGGCCACTGTTAAACG» из считываний Illumina была получена с использованием seqkit (17) с помощью пользовательских скриптов.

Рисунок логотипа последовательности был сделан WebLogo: https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi (18).

Чтобы получить распределение расстояний между сайтом-мишенью и сайтом интеграции транспозона, последовательности между последовательностью crРНК «GAGAAGTCATTTAATAAGGCCACTGTTAAACG» и конечной последовательностью транспозона «TGTTGTTTGAAGTATAAGTTGGCATAAGTACAAACGA» или TGTTGATACATAAGTGAAG были считаны длиной, взятой из последовательностей «считывание длины» и были подсчитаны. Счетчики каждого PAM перечислены в дополнительной таблице S4.

Секвенирование нового поколения, анализ данных

Для определения сайтов интеграции и их распределения на основе данных полногеномного секвенирования (WGS) были выполнены подходы к картированию с разделением и чтением (с использованием пользовательских сценариев Bash), как сообщалось ранее (2).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Высокоэффективная РНК-управляемая транспозиция PtrCAST

Среди пяти типов CAST, CAST типа IV и I-E отсутствуют родственные транспозиционные белки (19,20), тогда как V-K CAST генерируют коинтегрируемые продукты донорской плазмиды (13–16).Поэтому представляющие интерес CAST с полными компонентами и высокой эффективностью были отобраны из CAST типов I-B и I-F для характеристики активности (21, 22) (последовательности и номера доступа перечислены в дополнительной таблице S5). Среди них высокоактивные CAST были дополнительно протестированы на ортогональность с помощью VchCAST.

CAST-элементы типа I-F3 из V ibrio natriegens ATCC 14048 амплифицировали из геномной ДНК. CAST-элементы типа I-F3, полученные из Pseudoaltermonas translucida KMM520, CAST-элементы типа I-B1, полученные из Anabaena variabilis ATCC 29413, и CAST-элементы типа I-B2, полученные из Cyanothece sp.PCC 8801 были синтезированы и оптимизированы в соответствии со смещением кодонов E. coli . CAST типа I-F3 были сконструированы на трех плазмидах pTns, pQCascade и pDonor (Рисунок 1A, дополнительная таблица S1): pTns экспрессировал Tn7-подобный транспозон, кодируемый генами tnsA , tnsB и tnsC с индуцибельным тетрациклином ( Тет) промоутеры; pQCascade экспрессировал ген tniQ и элементы, связанные с CRISPR, включая crRNA или массив CRISPR (уникальные спейсеры, расположенные между повторами), гены cas6 , cas7 и cas5 / 8 с двумя промоторами Tet.pDonor содержит концы транспозона (левый конец (LE) и правый конец (RE)) и ген груза (рис. 1A). CAST типа I-B были сконструированы на трех плазмидах в аналогичной форме (рис. 1B, дополнительная таблица S1). Поскольку тип I-B CAST имеет Tn7-подобные гены tnsD и tniQ , ген tniQ также экспрессировался на pTnsABCQ в дополнение к генам tnsA , tnsB и tnsC . Гены tnsD , crRNA или CRISPR, cas5 , cas6 , cas7 и cas8 гены были сконструированы на pDCascade (рисунок 1B).

Рисунок 1.

Характеристика РНК-управляемой интеграции ДНК с использованием CRISPR-ассоциированных транспозаз (CAST). ( A ) CAST типа I-F3 из Pseudoalteromonas translucida KMM520 и Vibrio natriegens ATCC 14048. Схемы плазмид для экспериментов по транспозиции: pDonor включает RE-cargo-LE; pTns включает промотор Tet, гены tnsA , tnsB и tnsC ; pQCascade включает два промотора Tet, crRNA, которая состоит из двух повторов (серые ромбы) и одного спейсера (фиолетовый прямоугольник), гены tniQ , cas5 / 8 , cas7 и cas6 .( B ) CAST типа I-B из Anabaena variabilis ATCC 29413 и Cyanothece sp. PCC 8801. Схема плазмид для экспериментов по транспозиции: pDonor включает RE-cargo-LE; pTnsABCQ включает промотор Tet, гены tnsA , tnsB (или tnsAB ), tnsC и tniQ ; pDCascade включает два промотора Tet, crRNA, которая состоит из двух повторов (серые ромбы) и одного спейсера (фиолетовый прямоугольник), гены tnsD , cas8 , cas7 , cas6 и cas5 .( C ) Геномные локусы на BL21Star ™ (DE3), нацеленные на crRNA3, и пары праймеров ПЦР a / a’ и b / b’ для их селективной амплификации. PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. ( D ) Анализ транспозиции колоний с помощью crRNA3 на основе ПЦР, разделенный электрофорезом в агарозном геле. Левая полоса в отрицательном контроле представляет собой локус lacZ , а правая полоса — это локус lacZ на профаге λDE3. ( E ) Хроматограммы секвенирования по Сэнгеру для восходящих и нисходящих соединений геномно интегрированных транспозонов из экспериментов с crRNA3.TSD — это аббревиатура для обозначения дублирования целевого сайта. a — локус lacZ , а b — локус lacZ на профаге λDE3.

Рисунок 1.

Характеристика РНК-управляемой интеграции ДНК с использованием CRISPR-ассоциированных транспозаз (CAST). ( A ) CAST типа I-F3 из Pseudoalteromonas translucida KMM520 и Vibrio natriegens ATCC 14048. Схемы плазмид для экспериментов по транспозиции: pDonor включает RE-cargo-LE; pTns включает промотор Tet, гены tnsA , tnsB и tnsC ; pQCascade включает два промотора Tet, crRNA, которая состоит из двух повторов (серые ромбы) и одного спейсера (фиолетовый прямоугольник), гены tniQ , cas5 / 8 , cas7 и cas6 .( B ) CAST типа I-B из Anabaena variabilis ATCC 29413 и Cyanothece sp. PCC 8801. Схема плазмид для экспериментов по транспозиции: pDonor включает RE-cargo-LE; pTnsABCQ включает промотор Tet, гены tnsA , tnsB (или tnsAB ), tnsC и tniQ ; pDCascade включает два промотора Tet, crRNA, которая состоит из двух повторов (серые ромбы) и одного спейсера (фиолетовый прямоугольник), гены tnsD , cas8 , cas7 , cas6 и cas5 .( C ) Геномные локусы на BL21Star ™ (DE3), нацеленные на crRNA3, и пары праймеров ПЦР a / a’ и b / b’ для их селективной амплификации. PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. ( D ) Анализ транспозиции колоний с помощью crRNA3 на основе ПЦР, разделенный электрофорезом в агарозном геле. Левая полоса в отрицательном контроле представляет собой локус lacZ , а правая полоса — это локус lacZ на профаге λDE3. ( E ) Хроматограммы секвенирования по Сэнгеру для восходящих и нисходящих соединений геномно интегрированных транспозонов из экспериментов с crRNA3.TSD — это аббревиатура для обозначения дублирования целевого сайта. a — локус lacZ , а b — локус lacZ на профаге λDE3.

Для тестирования активности транспозиции CAST типа I-F3 три плазмиды трансформировали в E. coli BL21Star ™ (DE3). Груз на pDonor представляет собой ген хлорамфеникола без промотора, а pQCascade (Ptr) несет crRNA3, нацеленную на локусов lacZ в геноме (один находится в опероне lacZYA , другой — в профаге λDE3) (рис. 1C) , фланкированный 5′-CC-3 ‘примыкающим мотивом протоспейсера (PAM).CrRNA1, нацеленная на lacZ в геноме (дополнительная фигура S2A), переносимая на pQCascade (Vna), фланкирована 5′-TC-3 ‘PAM. После индукции с помощью aTC проводили ПЦР колоний с праймерами a / a ‘и b / b’ для идентификации вставки PtrCAST, а праймеры i / i ‘использовали для идентификации вставки VnaCAST. Наконец, PtrCAST способен к РНК-управляемой интеграции ДНК с 16 положительными полосами из 16 колоний (рис. 1D), но в VnaCAST не было обнаружено колонии вставки (дополнительный рисунок S2B).Ожидаемая вставка для PtrCAST представляет собой единственную полосу (~ 1,6 т.п.н.) по сравнению с отрицательным контролем. Дорожка 6 на фиг. 1D (часть crRNA-lacZ) имеет дополнительную полосу (~ 3,2 т.п.н.), которая представляет две копии RE-GFP-LE, проверенные на дополнительном рисунке S2C.

Вставленные колонии PtrCAST были затем секвенированы, и диаграмма пиков секвенирования на стыке для одной из колоний показывает дупликацию целевого сайта (TSD) как в локусах a, так и в b (локусы нацеливания crRNA3), что также доказывает, что ДНК-управляемая ДНК транспозиционная активность PtrCAST, потому что TSD является особенностью продуктов транспозиции Tn7 (рисунок 1E).

Поскольку PAM типа I-B CAST неизвестен, PAM проверяет CAST типа I-B1 из Anabaena variabilis ATCC 29413 и CAST типа I-B2 из Cyanothece sp. PCC 8801. Рандомизированную целевую библиотеку PAM генерировали с использованием синтезированных олигонуклеотидов оцДНК с 6 рандомизированными основаниями перед протоспейсером. Никаких вставок не было обнаружено с помощью ПЦР (дополнительная фигура S2D, E).

Характеристика последовательностей PAM, ориентации интеграции, посевной последовательности и точности генома PtrCAST

Прежде чем использовать жизнеспособный PtrCAST, необходимо получить больше знаний о его функциях, таких как предпочтения PAM, ориентация вставки, последовательность посева и точность генома.Чтобы определить, имеет ли PtrCAST предпочтение по отношению к конкретным PAM, была протестирована 21 crRNA, расположенная вдоль гена lacZ , охватывающая все 16 PAM (5′-CA-3 ‘, 5′-CG-3′, 5’-AT-3 ‘ , 5’-AA-3 ‘, 5′-AG-3′, 5’-GG-3 ‘тестировали дважды с двумя crРНК, а 5′-GC-3′ тестировали три раза с тремя crRNA) (дополнительная таблица S3 ). Эффективность вставки каждой crRNA определяли с помощью кПЦР, эффективность вставки 5’-CC-3 ‘нормализовали до 100% стандартизации (направление LR + направление RL) и рассчитывали относительную эффективность интеграции остальных PAM.PtrCAST может распознать все 16 видов PAM (рис. 2A), но 4 crРНК, фланкирующие 5’-AA-3 ‘, 5′-AG-3′, 5’-AT-3 ‘и 5’-GG-3 ‘Не имели интеграции, что может быть связано с низкой эффективностью связывания выбранных крРНК (дополнительный рисунок S3A). Предпочтение ориентации вставки можно узнать, протестировав эффективность вставки 16 PAM, определенную с помощью qPCR. Эффективность вставки в направлении LR из 16 crRNAs была только 10 ^–6 –10 ^–1 по сравнению с эффективностью в направлении RL (Figure 2B).

Рисунок 2.

PAM для типа I-F3 CAST из Pseudoalteromonas translucida KMM520 не консервативны, и в них можно вставлять большие грузы. ( A ) Колеса PAM для вставок, управляемых РНК PtrCAST, идентифицированных с помощью qPCR. Стрелка в колесе показывает ориентацию каждой базы. Площадь сектора кольца для одного основания в одной позиции представляет его частоту в этой позиции. Эффективность вставки 5′-CA-3 ‘, 5′-CG-3′, 5’-AT-3 ‘, 5′-AA-3′, 5’-AG-3 ‘и 5’-GG-3 ‘- среднее значение двух crРНК; эффективность вставки 5’-GC-3 ‘в среднем для трех крРНК.( B ) Альтернативные ориентации интеграции для 16 PAM. Эффективность определяется количественной ПЦР. LR и RL обозначают продукты транспозиции, в которых левый и правый конец транспозона расположены проксимальнее сайта-мишени, соответственно. ( C ) Схема экранов PAM для PtrCAST. Оранжевая стрелка указывает каждую позицию последовательности PAM. ( D ) PAM для вставок, управляемых РНК PtrCAST, в ориентации RL, идентифицированной с помощью секвенирования следующего поколения (NGS). Рисунок выполняется WebLogo: https: // weblogo.berkeley.edu/logo.cgi. Положение соответствует оранжевой стрелке в C. ( E ) Анализ NGS расстояния между сайтом-мишенью Cascade и сайтом интеграции транспозона, определяемый с помощью PAM-экранов. ( F ) crРНК мутировали в 4-нуклеотидных блоках для введения несовпадений ДНК-спейсер-мишень (вверху), и полученные в результате эффективности интеграции определяли с помощью кПЦР (внизу). Данные нормализованы для гена rssA , количественно определено в трех биологических повторностях. ( G ) Количественная оценка эффективности вставки на основе ПЦР колоний с различными размерами груза и crRNA4, включая 1.3, 4,3 и 15,4 кб.

Рисунок 2.

PAM для типа I-F3 CAST от Pseudoalteromonas translucida KMM520 не консервативны и могут вставлять большие грузы. ( A ) Колеса PAM для вставок, управляемых РНК PtrCAST, идентифицированных с помощью qPCR. Стрелка в колесе показывает ориентацию каждой базы. Площадь сектора кольца для одного основания в одной позиции представляет его частоту в этой позиции. Эффективность вставки 5′-CA-3 ‘, 5′-CG-3′, 5’-AT-3 ‘, 5′-AA-3′, 5’-AG-3 ‘и 5’-GG-3 ‘- среднее значение двух crРНК; эффективность вставки 5’-GC-3 ‘в среднем для трех крРНК.( B ) Альтернативные ориентации интеграции для 16 PAM. Эффективность определяется количественной ПЦР. LR и RL обозначают продукты транспозиции, в которых левый и правый конец транспозона расположены проксимальнее сайта-мишени, соответственно. ( C ) Схема экранов PAM для PtrCAST. Оранжевая стрелка указывает каждую позицию последовательности PAM. ( D ) PAM для вставок, управляемых РНК PtrCAST, в ориентации RL, идентифицированной с помощью секвенирования следующего поколения (NGS). Рисунок выполняется WebLogo: https: // weblogo.berkeley.edu/logo.cgi. Положение соответствует оранжевой стрелке в C. ( E ) Анализ NGS расстояния между сайтом-мишенью Cascade и сайтом интеграции транспозона, определяемый с помощью PAM-экранов. ( F ) crРНК мутировали в 4-нуклеотидных блоках для введения несовпадений ДНК-спейсер-мишень (вверху), и полученные в результате эффективности интеграции определяли с помощью кПЦР (внизу). Данные нормализованы для гена rssA , количественно определено в трех биологических повторностях. ( G ) Количественная оценка эффективности вставки на основе ПЦР колоний с различными размерами груза и crRNA4, включая 1.3, 4,3 и 15,4 кб.

Чтобы избежать систематической ошибки отбора крРНК в указанном выше методе, скрининг PAM с высокой пропускной способностью выполняли следующим образом. Был сконструирован pTarget, включающий 5′-NNNNNN-3 ‘последовательность в качестве мишени для нацеливания под управлением crRNA, и трансформирован в E. coli BL21Star ™ (DE3) вместе с pTns, pQCascade (включая crRNA, нацеленную на pTarget), и pDonorCm. Все плазмиды в индуцированной E.coli экстрагировали и анализировали с помощью ПЦР с pTarget-специфическим праймером F и RE / LE-специфическими праймерами R / R ‘.Продукты ПЦР были проанализированы с помощью секвенирования следующего поколения (NGS) (рис. 2С). Для анализа обработанных данных использовался Weblogo (18,23), чтобы показать результаты, что PtrCAST имеет низкую степень сохранения PAM и относительное предпочтение CG PAM в ориентации RL (рис. 2D) и очевидное сохранение CT PAM в ориентации LR. (Дополнительный рисунок S3B). Низкая степень консервативности последовательности PAM в ориентации RL является более репрезентативной из-за ее сильного предпочтения вставки (фиг. 2B), что указывает на то, что PtrCAST не содержит PAM, а низкая сохранность CG PAM согласуется с рисунком 2A.Системы, связанные с CRISPR, обычно распознают определенные PAM, но PtrCAST, по-видимому, не имеет предпочтения PAM, что делает выбор цели более гибким при редактировании генома, как NgAgo (24). На экранах PAM 86,7% интеграций расположены в 48 п.н. от 3 ‘целевого сайта и 8,7% интеграций расположены на 51 п.н. от 3’ целевого сайта (рис. 2E).

Чтобы исследовать толерантность транспозиции к несовпадающим спейсерам, были протестированы последовательные блоки 4-нуклеотидных несовпадений вдоль спейсера crRNA4 (рис. 2F).Несоответствия в 4-нуклеотидной затравочной последовательности сильно снижают эффективность транспозиции, которая отличается от 8-нуклеотидной затравочной последовательности VchCAST. Чтобы охарактеризовать точность PtrCAST в масштабе всего генома, было выполнено секвенирование следующего поколения, и в каждом образце наблюдались заметные сайты вставки и интеграции вне мишени (15,8% для crRNA3 и 9,7% для транспозиции ДНК, управляемой crRNA4) в другом месте генома (дополнительный рисунок S3C и дополнительная таблица S6), что встречается чаще, чем VchCAST (со степенью интеграции менее 1%) (2,8).Верхние нецелевые сайты находились в гене pepQ для crRNA3 (9,8%) и гене ldhA для crRNA4 (4,3%). Наблюдали две потенциальные РНК-управляемые интеграции нецелевых, которые содержат 13/32 и 11/32 несовпадений соответственно с направляющей последовательностью (дополнительный рисунок S3D). Большее количество нецелевых событий по сравнению с VchCAST может быть результатом более гибкого PAM и допустимости управляющей последовательности PtrCAST.

PtrCAST может эффективно выполнять большие или мультиплексные вставки

VchCAST может интегрировать 0.98–10 kb гены карго в BL21 (DE3), но с увеличением размера гена эффективность постепенно снижается (12). После индуцирования при 37 ° C эффективность интеграции 10 т.п.н. составляет менее 25%. Эффективность интеграции можно повысить примерно до 100% за счет снижения температуры до 30 ° C и увеличения цикла интеграции (12). Эффективность встраивания генов карго PtrCAST в 1,3, 4,3 и 15,4 т.п.н. в BL21Star ™ (DE3) после индуцированного при 37 ° C в течение ночи составила 100% (8 из 8, 8 из 8, 16 из 16 колоний положительны соответственно) (рис. 2G, дополнительный рисунок S4A – C).Чтобы исключить разницу между штаммами, был сконструирован тот же груз в 15,4 т.п.н. для VchCAST и проведены эксперименты по транспозиции в BL21Star ™ (DE3). Следовательно, эффективность вставки VchCAST для больших грузов аналогична PtrCAST в BL21Star ™ (DE3) (дополнительный рисунок S4D), что указывает на то, что VchCAST имеет более высокую эффективность вставки в BL21Star ™ (DE3).

Чтобы проверить способность PtrCAST нацеливаться на несколько сайтов, на pQCascade-array8 был построен массив CRISPR, который имеет восемь различных спейсеров (рисунок 3A).После раунда транспозиции за один раз было получено 2-8 копий штаммов, из которых штаммы с восемью копиями составляли 12,5% от 16 колоний (дополнительный рисунок S5). Zhang et al. использовал VchCAST для нацеливания на восемь сайтов в BL21 (DE3), что требует трех пассажей для получения штаммов с восемью копиями (2). Следовательно, эффективность PtrCAST в нацеливании на несколько сайтов немного выше, чем у VchCAST (рисунок 3B, дополнительный рисунок S5).

Рисунок 3.

Характеристика эффективности мультиплексной вставки и двух видов crRNA для PtrCAST. ( A ) Схема мультиплексной РНК-управляемой вставки с восемью спейсерами CRISPR, нацеленными на восемь геномных локусов ( codA-cynR , uvrB-ybhK , ptsG-fhuE , ydgA-uidC , yeiI-nup yfhL-shoB , yhaL-yhaM , yliM-cpxA ) на BL21Star ™ (DE3). Груз GFP. ( B ) Количественная оценка эффективности вставки на основе ПЦР колоний с восемью спейсерами CRISPR, разделенная электрофорезом в агарозном геле.Количественная оценка данных проводилась по 16 колониям. ( C ) Схема двух видов повторяющихся последовательностей (R1 и R2) и crRNA (crRNA-AAGUU и crRNA-GAAAU). ( D ) Количественная оценка эффективности вставки на основе ПЦР колоний с crRNA4-AAGUU и crRNA4-GAAAU, разделенная электрофорезом в агарозном геле.

Рисунок 3.

Характеристика эффективности мультиплексной вставки и два вида crRNA для PtrCAST. ( A ) Схема мультиплексной РНК-управляемой вставки с восемью спейсерами CRISPR, нацеленными на восемь геномных локусов ( codA-cynR , uvrB-ybhK , ptsG-fhuE , ydgA-uidC , yeiI-nup yfhL-shoB , yhaL-yhaM , yliM-cpxA ) на BL21Star ™ (DE3).Груз GFP. ( B ) Количественная оценка эффективности вставки на основе ПЦР колоний с восемью спейсерами CRISPR, разделенная электрофорезом в агарозном геле. Количественная оценка данных проводилась по 16 колониям. ( C ) Схема двух видов повторяющихся последовательностей (R1 и R2) и crRNA (crRNA-AAGUU и crRNA-GAAAU). ( D ) Количественная оценка эффективности вставки на основе ПЦР колоний с crRNA4-AAGUU и crRNA4-GAAAU, разделенная электрофорезом в агарозном геле.

Поскольку две последовательности естественных повторов, которые чередуются с целевым спейсером на хромосоме Pseudoalteromonas translucida KMM520, имеют различия в 3 п.н., они были названы повтором 1 (R1) и повтором 2 (R2) (Рисунок 3C).Метод кроссовера R1 и R2 использовался при разработке массива CRISPR, который имеет 8 различных разделителей, а именно R1-S1-R2-S2-R1-S3-R2-S4-R1-S5-R2-S6-R1-S7-R2. -S8-R1 (Рисунок 3A). Петасси и др. изучали форму процессинга crRNA CAST типа I-F3 (7), поэтому в соответствии с ней PtrCAST может обрабатывать две неидентичные формы crRNA, названные crRNA-AAGUU и crRNA-GAAAU (рис. 3C). И crRNA-AAGUU, и crRNA-GAAAU являются активными формами, подтвержденными массивом CRISPR, который имеет восемь различных спейсеров.Кроме того, были сконструированы комбинирующие формы R1-спейсер-R1 и R2-спейсер-R2, которые продуцировали формы crRNA crRNA4-AAGUU и crRNA-GAAAU соответственно. Эффективность транспозиции форм R1-спейсер-R1 и R2-спейсер-R2 была 100% (8 из 8, 8 из 8 колоний положительны соответственно) (Рисунок 3D).

PtrCAST работает ортогонально с VchCAST

Во-первых, был проведен тест, подтверждающий, что PtrCAST и VchCAST могут распознавать только соответствующие им концевые последовательности транспозонов.pQCasTns (Vch) -crRNA2 и pDonorGFP (Ptr), нацеленные на локус между геном purT и eda , или pQCasTns (Ptr) -crRNA4 и pDonorVerA (Vch) (VerA — последовательность терминатора), нацеленные на локус lacZ котрансформирована в E. coli BL21Star ^TM (DE3) (фиг. 4A). Идентификация ПЦР была проведена после индуцированной aTC, и было обнаружено, что две комбинации не дали перекрестной реакции, что указывает на то, что они могут ортогонально идентифицировать разные концевые последовательности (рис. 4B).

Рисунок 4.

Ортогональность между PtrCAST и VchCAST. ( A ) Схема распознавания конца транспозона между PtrCAST и VchCAST. ( B ) Зондирование продуктов ПЦР на предмет распознавания конца транспозона в локусе crRNA2 или локусе crRNA4 с помощью обеих систем, разделенное с помощью гель-электрофореза. Интеграция происходит только при родственном спаривании между экспрессирующей и донорской плазмидами. ( C ) Схема ортогональных CAST с использованием четырех плазмид и pQCasTns управляет экспрессией белок-РНК с помощью одного промотора.( D ) Геномные локусы на BL21Star ^TM (DE3), нацеленные на crRNA4 с помощью PtrCAST и crRNA2 с VchCAST, и пары праймеров PCR c / c ’и d / d’ избирательно амплифицируют их. PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. ( E ) Анализ транспозиции колоний с использованием crRNA4 и crRNA2 на основе ПЦР, разделенный электрофорезом в агарозном геле.

Рисунок 4.

Ортогональность между PtrCAST и VchCAST. ( A ) Схема распознавания конца транспозона между PtrCAST и VchCAST.( B ) Зондирование продуктов ПЦР на предмет распознавания конца транспозона в локусе crRNA2 или локусе crRNA4 с помощью обеих систем, разделенное с помощью гель-электрофореза. Интеграция происходит только при родственном спаривании между экспрессирующей и донорской плазмидами. ( C ) Схема ортогональных CAST с использованием четырех плазмид и pQCasTns управляет экспрессией белок-РНК с помощью одного промотора. ( D ) Геномные локусы на BL21Star ^TM (DE3), нацеленные на crRNA4 с помощью PtrCAST и crRNA2 с VchCAST, и пары праймеров PCR c / c ’и d / d’ избирательно амплифицируют их.PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. ( E ) Анализ транспозиции колоний с использованием crRNA4 и crRNA2 на основе ПЦР, разделенный электрофорезом в агарозном геле.

Затем была протестирована ортогональность PtrCAST и VchCAST, при этом были трансформированы четыре плазмиды (рис. 4C), включая pQCasTns (Vch) -crRNA2, pQCasTns (Ptr) -crRNA4, pDonorVerA (Vch) и pDonorGFP (Ptr) в 900 E. coli BL21Star ™ (DE3). Суммарный размер RE-груза VerA-LE pDonorVerA (Vch) составлял около 0,84 kb, а суммарный размер RE-груза GFP -LE pDonorGFP (Ptr) был около 2.03 kb (рисунок 4D). После индукции aTC эффективность вставки VchCAST определялась с помощью ПЦР колоний с использованием праймера d / d ‘. Размер положительной полосы должен составлять 1,50 кб, а размер отрицательной полосы — 0,66 кб. Использование праймера c / c ‘для определения эффективности вставки PtrCAST, где размер положительной полосы должен составлять 2,27 т.п.н., а размер отрицательной полосы — 0,24 т.п.н. VchCAST и PtrCAST нацелены на соответствующие сайты параллельно и вставляют соответствующие гены карго с эффективностью около 100% (16 из 16 колоний являются положительными) (рис. 4E).Результаты были подтверждены секвенированием по Сэнгеру (дополнительный рисунок S6). В результате PtrCAST и VchCAST могут вставлять свой соответствующий груз в соответствующие локусы crRNA2 и crRNA4, не мешая друг другу, достигая ортогональности 1 (PtrCAST) × 1 (VchCAST).

Создание мультиплексной ортогональной системы транспонирования, связанной с CRISPR, с использованием PtrCAST и VchCAST

После доказательства ортогональности 1 (PtrCAST) × 1 (VchCAST) мультиплексированная ортогональность была проверена посредством ортогональности 2 (PtrCAST) × 1 (VchCAST).VchCAST нацелил локус между purT и eda геном с терминаторным грузом, а PtrCAST нацелил локусы lacZ с грузом GFP (рис. 5A). После индукции при 37 ° C использовали ПЦР колоний с праймерами d / d ‘для определения эффективности вставки VchCAST, а ПЦР колоний с праймерами a / a’ и b / b ‘использовали для определения эффективности вставки PtrCAST. Размер положительных полос должен быть 2,20 и 2,36 кб соответственно, а размер отрицательных полос должен быть 0.17 и 0,33 кб соответственно. И VchCAST, и PtrCAST нацелены на соответствующие сайты и вставляют соответствующие гены карго с эффективностью около 100% (16 из 16 колоний являются положительными), в результате чего получается штамм с желаемой вставкой 2 (PtrCAST) * 1 (VchCAST) (рис. 5A). .

Рисунок 5.

Мультиплексированная ортогональная транспозиция с использованием PtrCAST и VchCAST. ( A ) Вверху: геномные локусы на BL21Star ™ (DE3), нацеленные на crRNA3 с помощью PtrCAST и crRNA2 с VchCAST, и пары праймеров ПЦР a / a ’, b / b’ и d / d ’для их селективной амплификации.PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. Внизу: анализ транспозиции колоний с использованием crRNA3 и crRNA2, основанный на ПЦР, разделенный электрофорезом в агарозном геле. Левая полоса в отрицательном контроле представляет собой локус lacZ , а правая полоса — это локус lacZ на профаге λDE3. ( B ) Вверху: геномные локусы на BL21Star ™ (DE3), нацеленные на четыре спейсера CRISPR с PtrCAST и crRNA3 с VchCAST, а также пары праймеров для ПЦР e / e ‘, f / f’, g / g ‘, h / h ‘, a / a’ и b / b ‘для их выборочного усиления.PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. Внизу: анализ транспозиции колоний на основе ПЦР с четырьмя спейсерами CRISPR и crRNA3, разделенный электрофорезом в агарозном геле. Левая полоса в отрицательном контроле представляет собой локус lacZ , а правая полоса — это локус lacZ на профаге λDE3. ( C ) Вверху: геномные локусы на BL21Star ™ (DE3), нацеленные crRNA-IS186 с PtrCAST и crRNA3 с VchCAST, и пары праймеров ПЦР IS186F / IS186R (1-5), a / a ‘и b / b’ для их выборочного усиления.PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. Внизу: анализ транспозиции колоний на основе ПЦР с crRNA-IS186 и crRNA3, разделенный электрофорезом в агарозном геле. Левая полоса в отрицательном контроле представляет собой локус lacZ , а правая полоса — это локус lacZ на профаге λDE3.

Рисунок 5.

Мультиплексированная ортогональная транспозиция с использованием PtrCAST и VchCAST. ( A ) Вверху: геномные локусы на BL21Star ™ (DE3), нацеленные на crRNA3 с помощью PtrCAST и crRNA2 с VchCAST, и пары праймеров ПЦР a / a ’, b / b’ и d / d ’для их селективной амплификации.PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. Внизу: анализ транспозиции колоний с использованием crRNA3 и crRNA2, основанный на ПЦР, разделенный электрофорезом в агарозном геле. Левая полоса в отрицательном контроле представляет собой локус lacZ , а правая полоса — это локус lacZ на профаге λDE3. ( B ) Вверху: геномные локусы на BL21Star ™ (DE3), нацеленные на четыре спейсера CRISPR с PtrCAST и crRNA3 с VchCAST, а также пары праймеров для ПЦР e / e ‘, f / f’, g / g ‘, h / h ‘, a / a’ и b / b ‘для их выборочного усиления.PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. Внизу: анализ транспозиции колоний на основе ПЦР с четырьмя спейсерами CRISPR и crRNA3, разделенный электрофорезом в агарозном геле. Левая полоса в отрицательном контроле представляет собой локус lacZ , а правая полоса — это локус lacZ на профаге λDE3. ( C ) Вверху: геномные локусы на BL21Star ™ (DE3), нацеленные crRNA-IS186 с PtrCAST и crRNA3 с VchCAST, и пары праймеров ПЦР IS186F / IS186R (1-5), a / a ‘и b / b’ для их выборочного усиления.PAM и целевые сайты вместе выделены серым цветом. Внизу: анализ транспозиции колоний на основе ПЦР с crRNA-IS186 и crRNA3, разделенный электрофорезом в агарозном геле. Левая полоса в отрицательном контроле представляет собой локус lacZ , а правая полоса — это локус lacZ на профаге λDE3.

Поскольку каждый CAST использует две плазмиды при проверке ортогональности, процесс преобразования отнимал много времени. Чтобы сократить этот процесс, pQCasTns и pDonor каждой системы транспозиции были объединены в pAIO, используя один промотор для управления экспрессией белка (дополнительный рисунок S7A).Таким образом, только две плазмиды необходимо было ввести в одну клетку E. coli , и слияние всех компонентов каждой CAST в одну плазмиду не привело к каким-либо изменениям эффективности вставки (дополнительный рисунок S7B).

Следующие эксперименты увеличили количество целей, на которые нацелена каждая система, нацелив локусов lacZ на геном с помощью VchCAST, несущего груз VerA, и разработали массив CRISPR, который имеет четыре спейсера, нацеленных на nagB , nagE и гены manX с PtrCAST, несущие грузовой GFP.Есть два спейсера из четырех спейсеров в одном массиве CRISPR на расстоянии 480 п.н., которые оба нацелены на ген manX (рис. 5B). После индукции при 37 ° C использовали ПЦР колоний с праймерами a / a ‘и b / b’ для определения эффективности вставки VchCAST. Размер положительных полос должен составлять 1,0 и 1,17 т.п.н., а размер отрицательных полос — 0,17 и 0,33 т.п.н. соответственно. Праймеры выше и ниже по потоку e / e ’, f / f’, g / g ’и h / h’ использовали для определения эффективности вставки nagB , nagE и manX .Размер положительных полос составлял примерно 2,47, 2,70, 2,49 и 2,36 т.п.н., а размер отрицательных полос должен составлять 0,43, 0,66, 0,46 и 0,33 т.п.н. В конце концов, PtrCAST и VchCAST нацелены на соответствующие 4 и 2 локуса, не мешая друг другу, и были получены штаммы с желаемой вставкой 2 (VchCAST) × 4 (PtrCAST), что доказывает ортогональность 2 (VchCAST) × 4 (PtrCAST), и эффективность составила около 100% (5 из 5 колоний положительные) (Рисунок 5B).

Затем был проведен тест на большем количестве мишеней для 2 (VchCAST) × 5 (PtrCAST), все еще нацеленный на локусы lacZ в геноме, несущем груз VerA, и был заменен массив CRISPR PtrCAST на crRNA, нацеленный на пять сайтов IS186. , несущий груз GFP (Рисунок 5C).После индукции при 37 ° C использовали ПЦР колоний с праймерами a / a ‘и b / b’ для определения эффективности вставки VchCAST. Размер положительных полос должен составлять 1,0 и 1,17 т.п.н., а размер отрицательных полос — 0,17 и 0,33 т.п.н. соответственно. Праймеры IS186F / IS186R (1-5) использовали для определения эффективности вставки пяти сайтов, на которые нацелено PtrCAST. Размер положительных полос составлял от 2,0 до 2,1 кб, а размер отрицательных полос должен составлять 0,78, 0,73, 0,79, 0,73 и 0.85 кб соответственно. Был получен штамм с желаемой вставкой 2 (VchCAST) × 5 (PtrCAST), что указывает на возможность достижения ортогональности 2 (VchCAST) × 5 (PtrCAST) (рис. 5C). В заключение, VchCAST и PtrCAST могут вставлять соответствующие гены карго в их соответствующие 2 и 5 локусов с эффективностью около 100% (6 из 6 колоний являются положительными), не мешая друг другу.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании был идентифицирован CAST, который показал высокую активность в управляемой РНК транспозиции ДНК без предпочтения PAM и толерантный к несовпадениям crRNA.PtrCAST и VchCAST могут эффективно вставлять свои соответствующие грузы в соответствующие пять и два локуса, не мешая друг другу.

CAST должны соответствовать трем условиям для достижения полной ортогональности. Во-первых, последовательности RE / LE должны отличаться. Во-вторых, распознаваемые PAM должны быть разными. Наконец, повторяющиеся последовательности должны быть разными. Последовательности RE / LE PtrCAST и VchCAST различны, и они могут ортогонально идентифицировать конечные последовательности в нашем эксперименте.Однако гибкий PAM PtrCAST и сходство повторяющихся последовательностей между двумя CAST могут привести к перекрестной реактивности среди других комбинаций их спейсеров. CAST типа I-B имеют более длинную и непохожую повторяющуюся последовательность, что может быть идеальным партнером CAST типа I-F3.

Недавно Saito et al. обнаружил вставки (эффективность менее 1%) с использованием CAST типа I-B1 из Anabaena variabili ATCC 29413 (AvCAST), который здесь не обнаружен (9). Для этого может быть две причины.Во-первых, внешние праймеры целевого сайта были использованы для обнаружения колоний с помощью ПЦР, а размер полосы был использован для оценки возникновения событий интеграции, в то время как Saito et al. использовал RE-cargo-LE-специфические праймеры и внешние праймеры целевого сайта для обнаружения ddPCR (9). В принципе, последний метод намного более чувствителен, и вставки с эффективностью менее 1% могут быть обнаружены в популяции колонии. Во-вторых, в нашем эксперименте были сохранены гены tnsD и tniQ I-B1 CAST, и Saito et al. обнаружил, что отключение гена tnsD может повысить эффективность и увеличить вероятность наблюдения редкого события инсерции (9).

Эффективность вставки семи CAST была проверена методом qPCR для прямого сравнения (дополнительный рисунок S8). Для большинства CAST использовались высокоэффективные прокладки из соответствующих оригинальных изделий. Для PmcCAST использовался спейсер, нацеленный на локус гена lacZ , поскольку Saito et al. протестировал только один спейсер, нацеленный на плазмиду, для скрининга PAM (9).Помимо неожиданно низкой эффективности вставки ShoCAST в наших руках, ShCAST, VchCAST, AsaCAST, AvCAST и PmcCAST соответствовали их статьям. Хотя эффективность вставки PtrCAST является самой высокой среди семи CAST в этом испытании (дополнительный рисунок S8), трудно утверждать, что PtrCAST в целом более эффективен, чем другие CAST, поскольку был протестирован только один целевой сайт. В целом, эффективность вставки CAST типа I-B должна быть увеличена для удовлетворения требований конструирования штаммов в клеточной инженерии.

Будет продолжено изучение других CAST, чтобы найти те, которые ортогональны как PtrCAST, так и VchCAST, а развертывание мультиплексированного MUCICAT еще больше увеличит скорость построения спроектированных ячеек.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Необработанные данные о последовательностях, представленные в этой статье, включая WGS для сайтов интеграции, скрининг PAM и штамм BL21Star ^TM (DE3), были депонированы в BioProject / SRA: PRJNA747763 и PRJNA747754 и в архиве геномных последовательностей (25) National Genomics Центр данных (26) Пекинского института геномики (BIG) Китайской академии наук, инвентарный номер CRA004516 и CRA004528, которые общедоступны по адресу https: // ngdc.cncb.ac.cn/gsa.

Геномные различия между BL21 (DE3) и BL21 Star ™ (DE3) перечислены в дополнительной таблице S7.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы с благодарностью благодарим профессора Сэмюэля Х. Стернберга, профессора Джозефа Э. Петерса и профессора Фэн Чжана за предоставление плазмид, кодирующих различные CAST. Вклад авторов: S.Q.Y. и С.Ю. разработал общий метод и подход. Y.J., J.J.Y. и С.Ю. руководил исследованием. S.Q.Y. сконструировали плазмиды и штаммы и выполнили эксперименты по транспозиции. J.J.Y. проанализировали данные NGS. S.Q.Y., Y.W.Z., J.Q.X., J.Z. проверили CAST для экспериментов. S.Q.Y., Y.W.Z., J.Z.Z. и С.Ю. написал рукопись. Все авторы прочитали и прокомментировали рукопись.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Национальный фонд естественных наук Китая [21825804, 31921006]; Крупный проект муниципальной науки и техники Шанхая.

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.

Alper

H.

,

Miyaoku

K.

,

Stephanopoulos

G.

Конструирование штаммов E. coli с избытком ликопина путем комбинирования систематического и комбинаторного нокаута генов достигает

.

Nat. Biotechnol.

2005

;

23

:

612

—

616

.2.

Чжан

Ю.В.

,

Вс

X.M.

,

Ван

Q.Z.

,

Сюй

J.Q.

,

Донг

F.

,

Ян

S.Q.

,

Ян

J.W.

,

Чжан

Z.X.

,

Qian

Y.

,

Chen

J.

et al. .

Множественная хромосомная интеграция с использованием CRISPR-ассоциированных транспозаз

.

ACS Synth. Биол.

2020

;

9

:

1998

—

2008

.3.

Аджикумар

P.K.

,

Сяо

W.H.

,

Tyo

K.E.J.

,

Wang

Y.

,

Simeon

F.

,

Leonard

E.

,

Mucha

O.

,

Phon

T.H.

,

Pfeifer

B.

,

Stephanopoulos

G.

Оптимизация пути изопреноидов для избыточной продукции предшественников таксола в Escherichia coli

.

Наука (Нью-Йорк, Нью-Йорк)

.

2010

;

330

:

70

—

74

.4.

Ян

C.

,

Гао

X.

,

Jiang

Y.

,

Sun

B.

,

Gao

F.

,

Yang

S. Синергизм между метилэритритолфосфатным путем и мевалонатным путем для продукции изопрена в Escherichia coli

.

Metab. Англ.

2016

;

37

:

79

—

91

.5.

Feng

X.

,

Zhao

D.

,

Zhang

X.

,

Ding

X.

,

Bi

C. в Escherichia coli

.

Biotechnol. J.

2018

;

13

:

e1700604

.6.

Strecker

J.

,

Ladha

A.

,

Gardner

Z.

,

Schmid-Burgk

J.L.

,

Makarova

K.S.

,

Кунин

Е.В.

,

Zhang

F.

РНК-управляемая вставка ДНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами

.

Наука

.

2019

;

365

:

48

—

53

.7.

Петасси

M.T.

,

Hsieh

S.C.

,

Peters

J.E.

Категоризация направляющих РНК позволяет выбирать сайт-мишень в транспозонах Tn7-CRISPR-Cas

.

Ячейка

.

2020

;

183

:

1757– +

.8.

Кломпе

S.E.

,

Vo

P.L.H.

,

Халпин-Хили

Т.С.

,

Штернберг

S.H.

Транспозонно-кодируемые системы CRISPR – Cas направляют интеграцию ДНК под управлением РНК

.

Природа

.

2019

;

571

:

219

—

225

,9.

Saito

M.

,

Ladha

A.

,

Strecker

J.

,

Faure

G.

,

Neumann

E.

,

Altae-Tran

,

Macrae

RK

,

Zhang

F.

Двойные режимы CRISPR-ассоциированного наведения транспозона

.

Ячейка

.

2021

;

184

:

2441

—

2453

.10.

Халпин-Хили

Т.С.

,

Кломпе

S.E.

,

Штернберг

S.H.

,

Фернандес

I.S.

Структурная основа нацеливания ДНК с помощью кодируемой транспозоном системы CRISPR-Cas

.

Природа

.

2020

;

577

:

271

—

274

. 11.

Чжан

Ю.

,

Ян

Дж.

,

Ян

С.

,

Чжан

Дж.

,

Чен

Дж.

,

Тао

Р.

,

Цзян

Ян

Дж.

,

Ян

С.

Программирование клеток путем многокопийной хромосомной интеграции с использованием CRISPR-ассоциированных транспозаз

.

Журнал CRISPR

.

2021

;

4

:

350

—

359

.12.

Vo

P.L.H.

,

Ronda

C.

,

Klompe

S.E.

,

Chen

E.E.

,

Acree

C.

,

Wang

H.H.

,

Sternberg

S.H.

CRISPR-управляемая интеграция с РНК для высокоэффективной мультиплексной инженерии бактериального генома

.

Nat. Biotechnol.

2021

;

39

:

480

—

489

.13.

Рубин

B.E.

,

Diamond

S.

,

Cress

BF

,

Crits-Christoph

A.

,

He

C.

,

Xu

M.

,

Zhou

,

Smock

DC

,

Tang

K.

,

Owens

TK

et al. .

Целевое редактирование генома бактерий в микробных сообществах

.

2020

; https://doi.org/10.1101/2020.07.17.209189.14.

Vo

P.L.H.

,

Acree

C.

,

Smith

M.L.

,

Штернберг

S.H.

Беспристрастное профилирование продуктов транспозиции под управлением CRISPR РНК с помощью секвенирования с длинным считыванием

.

Моб. ДНК

.

2021

;

12

:

13

.15.

Рис

P.A.

,

Крейг

Н.L.

,

Dyda

F.

Комментарий к «РНК-управляемой вставке ДНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами»

.

Наука

.

2020

;

368

:

eabb2022

.16.

Strecker

J.

,

Ladha

A.

,

Makarova

K.S.

,

Кунин

Е.В.

,

Zhang

F.

Ответ на комментарий «РНК-управляемая вставка ДНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами

.

Наука

.

2020

;

368

:

eabb2920

.17.

Shen

W.

,

Le

S.

,

Li

Y.

,

Hu

F.Q.

SeqKit: кроссплатформенный и сверхбыстрый набор инструментов для работы с файлами FASTA / Q

.

PLoS One

.

2016

;

11

:

e0163962

. 18.

Crooks

G.E.

,

Hon

г.

,

Chandonia

J.M.

,

Brenner

S.E.

WebLogo: генератор последовательного логотипа

.

Genome Res.

2004

;

14

:

1188

—

1190

. 19.

Faure

G.

,

Shmakov

S.A.

,

Yan

W.X.

,

Cheng

D.R.

,

Скотт

Д.А.

,

Peters

J.E.

,

Makarova

K.С.

,

Кунин

Е.В.

CRISPR-Cas в мобильных генетических элементах: контрзащита и не только

.

Nat. Rev. Microbiol.

2019

;

17

:

513

—

525

.20.

Шмаков

S.

,

Smargon

A.

,

Scott

D.

,

Cox

D.

,

Pyzocha

N.

,

W.

Абудайе

О.O.

,

Gootenberg

J.S.

,

Макарова

К.С.

,

Вольф

Ю.И.

et al. .

Разнообразие и эволюция систем CRISPR-Cas класса 2

.

Nat. Rev. Microbiol.

2017

;

15

:

169

—

182

. 21.

Peters

J.E.

Направленная транспозиция с элементами Tn7: безопасные сайты, мобильные плазмиды, CRISPR / Cas и другие

.

Мол.Microbiol.

2019

;

112

:

1635

—

1644

. 22.

Петерс

J.E.

,

Макарова

К.С.

,

Шмаков

С.

,

Кунин

Е.В.

Рекрутирование систем CRISPR-Cas с помощью Tn7-подобных транспозонов

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2017

;

114

:

E7358

—

E7366

. 23.

Шнайдер

Т.Д.

,

Стивенс

Р.М.

Логотипы последовательностей: новый способ отображения согласованных последовательностей

.

Nucleic Acids Res.

1990

;

18

:

6097

—

6100

. 24.

Qu

J.Y.

,

Се

Ю.Л.

,

Го

Z.Y.

,

Лю

X.T.

,

Jiang

J.

,

Chen

T.

,

Li

K.

,

Hu

Z.

,

Luo

D.X.

Идентификация нового сайта расщепления и подтверждение эффективности редактирования гена NgAgo в отношении мишеней РНК

.

Мол. Biotechnol.

2021

; https://doi.org/10.1007/s12033-021-00372-1.25.

Ван

Y.Q.

,

Song

F.H.

,

Zhu

J.W.

,

Zhang

S.S.

,

Yang

Y.D.

,

Chen

T.T.

,

Tang

B.X.

,

Dong

L.L.

,

Ding

N.

,

Zhang

Q.

et al. .

GSA: архив последовательностей генома

.

Геном Протеом Биоинф

.

2017

;

15

:

14

—

18

. 26.

Чжан

З.

,

Чжао

W.M.

,

Сяо

J.F.

,

Bao

Y.М.

,

He

S.M.

,

Чжан

G.Q.

,

Li

Y.X.

,

Чжао

Г.П.

,

Чен

Р.С.

,

Gao

Y.

et al. .

Ресурсы базы данных Национального центра геномных данных на 2020 год

.

Nucleic Acids Res.

2020

;

48

:

D24

—

D33

.

Заметки автора

© Автор (ы) 2021.Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

COVID-19: Шотландия вводит паспорта вакцины с

октября

года Парламент Шотландии проголосовал за введение сертификатов вакцинации COVID-19 для посещения ночных клубов и других мероприятий, и страна стала первой в Великобритании, принявшей такую ​​меру.

Новый пропуск, который вступит в силу 1 октября, направлен на замедление роста числа случаев коронавируса, виной которых является новый учебный семестр, а также на предотвращение повторного введения новых ограничений на пандемию, заявил ранее министр здравоохранения Шотландии. голосование в Эдинбурге.

«Мы не хотим вновь вводить какие-либо ограничения, которые действовали большую часть этого года, поскольку все мы знаем, какой вред они нанесли бизнесу, образованию и общему благосостоянию людей. Но мы должен остановить рост числа дел «, — сказал Хумза Юсуф .

Свидетельства о вакцинации против COVID-19 потребуются для посещения ночных клубов, музыкальных фестивалей и некоторых футбольных матчей. Приложение для смартфона будет отслеживать прививочный статус людей.

По данным министерства здравоохранения, введение паспорта вакцины будет стимулировать молодых людей делать уколы.

Правительство Бориса Джонсона указало, что аналогичная мера может быть введена для въезда в клубы и стадионы в Англии, но никаких конкретных заявлений пока не поступало.

Каждая страна Соединенного Королевства применяет свои собственные ограничения по борьбе с коронавирусом. Как и Англия, Шотландия сняла большинство ограничений этим летом после длительного зимнего карантина, опираясь на успех британской вакцинации.