Бфл вк: Чемпионат BFL 20/21, BFL. Официальный сайт

—

—

—

MJ Simmons

¹ Центр для продвинутых Биотехнология и медицина, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

² Высшая программа по биохимии и молекулярной биологии, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

G Fan

¹ Центр передовых биотехнологий и медицины, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

² Высшая программа по биохимии и молекулярной биологии, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатау ай, Нью-Джерси, США

WX Zong

¹ Центр передовых биотехнологий и медицины, UMDNJ—Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

² Высшая программа по биохимии и молекулярной биологии, UMDNJ—Роберт Медицинская школа Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

K Дегенхардт

¹ Центр передовых биотехнологий и медицины, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

E White

¹ Центр Продвинутая биотехнология и медицина, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

³ Кафедра молекулярной биологии и биохимии, Университет Рутгерса, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США

⁴ Институт рака Нью-Джерси, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США

C Gélinas

¹ Центр передовых биотехнологий и медицины, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси , США

⁴ Институт рака Нью-Джерси, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США

⁵ Факультет биохимии, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

¹ Центр передовых биотехнологий и медицины, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

² Высшая программа по биохимии и молекулярной биологии, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси, США

³ Факультет молекулярной Биология и биохимия, Университет Рутгерса, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США

⁴ Институт рака Нью-Джерси, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США

⁵ Факультет биохимии, UMDNJ — Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Пискатауэй, Нью-Джерси , USA

⁶ Текущий адрес: Кафедра биологии рака, Медицинская школа Массачусетского университета, Вустер, Массачусетс 01650, США.

⁷ Текущий адрес: Кафедра молекулярной генетики и микробиологии, SUNY-Stony Brook, Stony Brook, NY 11794-5222, США.

Abstract

Выживающий член семейства Bcl-2 Bfl-1/A1 является транскрипционной мишенью ядерного фактора-κB (NF-κB), который сверхэкспрессируется во многих опухолях человека и является средством, с помощью которого NF-κB ингибирует апоптоз, но его способ действия является спорным.Чтобы лучше понять, как функционирует Bfl-1, мы исследовали его взаимодействие с проапоптотическими мультидоменными белками Bax и Bak, а также с Bh4-белками Bid и tBid. Мы показываем, что в живых клетках Bfl-1 избирательно взаимодействует с Bak и tBid, но не с Bax или Bid. Взаимодействие Bfl-1/Bak является функциональным, поскольку Bfl-1 подавляет индуцированный стауроспорином (STS) апоптоз в клетках дикого типа и Вах-дефицитных клетках, но не в клетках Bak-/-. Мы также показываем, что Bfl-1 косвенно блокирует активацию Bax, индуцированную фактором некроза опухоли-α (TNFα), через связь с tBid.Делеция С-конца снижала взаимодействие Bfl-1 с Bak и tBid и снижала его способность подавлять Bak- и tBid-опосредованную гибель клеток. Эти данные показывают, что Bfl-1 использует различные механизмы для подавления апоптоза в зависимости от стимула. Bfl-1 связывается с tBid, чтобы предотвратить активацию проапоптотических Bax и Bak, а также напрямую взаимодействует с Bak, чтобы противодействовать опосредованной Bak гибели клеток, подобно Mcl-1. Таким образом, часть защитной функции NF-κB заключается в индукции Mcl-1-подобной активности путем усиления Bfl-1.

Ключевые слова: Bfl-1, A1, Bcl2a1, tBid, Bak, апоптоз

Введение

Взаимодействия между белками семейства Bcl-2 контролируют клеточную судьбу в ответ на сигналы, индуцирующие гибель ). Белки, содержащие только проапоптотический Bh4 (Bid, Bad, Bim, Puma, Noxa, Hrk, Bmf, Nbk/Bik), инициируют передачу сигналов апоптоза в ответ на вызывающие смерть стимулы. Многодоменные белки Bax и Bak являются важными эффекторами апоптоза, и клетки, лишенные обоих белков, невосприимчивы к апоптозу, индуцированному широким спектром стимулов.Напротив, антиапоптотические члены семейства Bcl-2 Bcl-2, Bcl-x _L , Bfl-1/A1, Mcl-1 и Bcl-w защищают клетки от апоптоза. Некоторые белки, содержащие только Bh4, такие как tBid и Bim, запускают конформационную активацию Bax и Bak, в то время как другие, такие как Bad, Noxa и Bik, секвестрируют антиапоптотические члены семейства Bcl-2 и нейтрализуют их защитную активность (Letai et al. , 2002). ; Chen и др., 2005; Kuwana и др. , 2005).

Апоптоз может быть инициирован внешним путем, включающим активацию рецепторов смерти, или внутренним путем, запускаемым различными формами клеточного стресса.Во внутриклеточном пути апоптотические сигналы сходятся на митохондриях, чтобы вызвать высвобождение цитохрома C (cyto C ) в цитозоль, вызывая активацию каспазы и гибель клетки. Во внешнем пути лиганды, такие как фактор некроза опухоли-α (TNFα), вызывают опосредованную рецептором смерти активацию каспазы-8, которая расщепляет Bid до его активной формы tBid. В свою очередь, tBid индуцирует конформационную активацию и олигомеризацию Bax и Bak, высвобождение митохондриального цито C , активацию каспазы и апоптоз (Perez and White, 2000; Wei et al., 2000). В то время как антиапоптотические Bcl-2 и Bcl-x _L могут связываться как с Bid, так и с tBid, Mcl-1 ингибирует апоптоз, индуцированный рецептором смерти, путем селективного связывания с tBid, но не с Bid (Cheng et al. , 2001; Clohessy). и др. , 2006). Более того, Mcl-1 изолирует эндогенный Bak, но не Bax в здоровых клетках, и блокирует Bak-опосредованную гибель клеток, а Bcl-2 этого не делает (Cuconati et al. , 2003; Willis et al. , 2005). Аденовирусный гомолог Bcl-2 E1B 19K препятствует гибели клеток, связываясь непосредственно с Bax и Bak, но не с tBid или Bid (Oltvai et al. , 1993; Перес и Уайт, 2000 г.; Куконати и др. , 2002; Cuconati and White, 2002), но как другие антиапоптотические члены семейства Bcl-2, такие как Bfl-1, блокируют апоптоз, не совсем ясно.

Bfl-1/A1 является транскрипционной мишенью ядерного фактора-κB (NF-κB), который подавляет апоптоз в ответ на несколько вызывающих смерть стимулов, включая TNFα и стауроспорин (STS; Karsan et al. , 1996; D ‘Sa-Eipper and Chinnadurai, 1998; Grumont и др. , 1999; Lee и др., 1999; Ван и др. , 1999; Зонг и др. , 1999; Шомоджи и др. , 2001). Bfl-1/A1 не имеет значительной гомологии с доменом Bh5, который необходим для защитной активности Bcl-2 и Bcl-x _L , а его С-концевая область содержит заряженные остатки и вряд ли будет действовать как трансмембранный домен, подобный которые прикрепляют Bcl-2 и Bcl-x _L к митохондриальным мембранам (Nguyen et al. , 1993). Это предполагает, что Bfl-1 может действовать иначе, чем Bcl-2 и Bcl-x _L , блокируя апоптоз, и имеются противоречивые сообщения относительно его способности связываться с Bax, Bak, Bid и tBid. Сообщалось, что человеческий Bfl-1 взаимодействует с Bid в временно трансфицированных клетках и с рекомбинантным tBid in vitro , но не с Bax или Bak (Werner et al. , 2002). Было описано, что Bfl-1/A1 связывается с Bax в двухгибридных дрожжах или путем совместной иммунопреципитации in vitro транслированных белков (Sedlak et al. , 1995; Zhang et al. , 2000). Другие исследователи не обнаружили связи между A1 мыши и Bax в котрансфицированных клетках, но A1 взаимодействовал с Bak в этих условиях (Holmgreen et al., 1999). Здесь мы исследовали связь Bfl-1 с эндогенными Bax, Bak, Bid и tBid в живых клетках и изучили, как эти взаимодействия связаны с его защитной активностью в ответ на внешние и внутренние стимулы, вызывающие смерть.

Результаты

Поскольку Bfl-1 гиперэкспрессируется при многих видах рака, мы экспрессировали Bfl-1 в клетках MCF-7 и подтвердили его способность подавлять высвобождение митохондриального цито C при активации TNFα внешнего сигнального каскада смерти. Bfl-1 был помечен с N-конца зеленым флуоресцентным белком (GFP), поскольку коммерческие антитела не смогли успешно распознать Bfl-1 человека. GFP-Bfl-1 локализуется в митохондриях и околоядерной области, перекрывая эндогенный цито C (). В то время как TNFα провоцировал высвобождение цито C в экспрессирующих GFP клетках, цито C оставался митохондриально локализованным в GFP-Bfl-1-положительных клетках, что согласуется с его защитной активностью в отношении TNFα (Karsan et al. , 1996; Wang ). и другие., 1999; Зонг и др. , 1999). Мутант GFP-Bfl-1ΔC, лишенный С-концевых 24 аминокислот, распространялся по всей клетке, включая ядро, подобно GFP, но все еще подавлял TNFα-индуцированное высвобождение цито C . Высвобождение Cyto C и апоптоз критически зависят от конформационной активации и олигомеризации Bax и Bak, которые ингибируются антиапоптотическими Bcl-2 и Bcl-x _L . Точно так же GFP-Bfl-1 и Bfl-1ΔC подавляли TNFα-индуцированную конформационную активацию Bax, как видно из антитела, специфичного к N-концу Bax, которое маскируется, когда Bax неактивен, и экспонируется при активации Bax (; Desagher et al. ., 1999; Перес и Уайт, 2000). Напротив, Bax активировался в окружающих клетках, в которых отсутствовала значительная экспрессия GFP-Bfl-1. Таким образом, Bfl-1 и Bfl-1ΔC подавляют активацию Bax в ответ на TNFα.

Bfl-1 и Bfl-1ΔC подавляют TNα-индуцированное высвобождение цито C . Иммунофлуоресценция клеток MCF-7, трансфицированных GFP ( a – f ), GFP-Bfl-1 ( g – n ) или –Bfl1ΔC ( o–v ) с ( d 9 F , K — N ; с — S — S — S — S ) или без ( C — г , г — j , o — R ) Лечение TKFα для 8 h, с использованием анти-цито C антитела ( c , f , i , m , q , u ). Клетки также анализировали на флуоресценцию GFP ( b , e , h , l , p , t ). Цито С , цитохром С ; GFP, зеленый флуоресцентный белок; TNFα, фактор некроза опухоли-α.

Bfl-1 и BfI-1ΔC подавляют TNFα-индуцированную конформационную активацию Bax. Иммунофлуоресценция активированного Bax в клетках MCF-7, трансфицированных GFP ( a – d ), GFP-Bfl-1 ( e – h ) или -Bfl-1ΔC ( i – l ) С ( C и D , г и ч 9175 и ч , к и к и л и л ) или без ( A и B , E и F , I и j ) Обработка TNFα с использованием антитела против BaxNT ( b , d , f , h , j , l ). Клетки также анализировали на флуоресценцию GFP (—, -с-, —, —, -1-, —). Звездочками отмечены GFP-Bfl-1 или -Bfl-1 AC-положительные клетки, которые не показали активации Bax.

Члены семейства антиапоптотических Bcl-2 блокируют апоптоз, взаимодействуя с проапоптотическими белками, состоящими только из Bh4, и/или с мультидоменными белками Bax и Bak. Bcl-2 и E1B 19K взаимодействуют с Bax, блокируя его олигомеризацию и апоптоз (Oltvai et al. , 1993; Perez and White, 2000; Cuconati and White, 2002; Cuconati et al., 2002), но связь Bfl-1 с Bax была предметом противоречивых сообщений (Sedlak et al. , 1995; Holmgreen et al. , 1999; Zhang et al. , 2000; Werner ). и др. , 2002). Мы спросили, противодействует ли Bfl-1 активации Bax посредством прямого взаимодействия с экстрактами 3-((3-холамидопропил)диметиламмонио)-1-пропансульфоната (CHAPS), поскольку другие детергенты могут влиять на конформацию Bax и его взаимодействие с Bcl-2 (Hsu and Youle). , 1998). Хотя Bfl-1 и Bfl-1ΔC ко-иммунопреципитируются со сверхэкспрессированным FLAG-Bax (1), ни один из них не связан ни с эндогенным Bax, активированным TNFα/циклогексимидом (CHX), ни с неактивным Bax в клетках, обработанных CHX, несмотря на эффективную иммунопреципитацию Bax (2).Обратная иммунопреципитация эндогенного Bax с помощью GFP-Bfl-1 или 2×Myc-Bfl-1 также не удалась, в отличие от контрольной иммунопреципитации эндогенного Bax с помощью Bak (14). Т.о., хотя Bfl-1 может ассоциироваться со сверхэкспрессией Bax, комплексов с эндогенным Bax не наблюдалось, что свидетельствует о том, что он противодействует активации Bax, взаимодействуя с факторами, действующими выше каскада TNF α.

Bfl-1 и Bfl-1ΔC могут взаимодействовать со сверхэкспрессированным Bax, но не могут связываться с эндогенным Bax независимо от статуса активации Bax.( a ) Совместная иммунопреципитация GFP-Bfl-1 или -Bfl-1ΔC со сверхэкспрессией FLAG-Bax в экстрактах CHAPS из котрансфицированных клеток HeLa. ( b ) Иммунопреципитация 2×Myc-Bfl-1 или -Bfl-1ΔC с эндогенным Bax в клетках HeLa, обработанных TNFα плюс CHX или только CHX, с использованием антител против Bax-loop и иммуноблоттинга с анти-Myc или -BaxN20 антитело. Lys: 1/10 вводного лизата. CHX, циклогексимид; GFP, зеленый флуоресцентный белок; TNFα, фактор некроза опухоли-α.

Bfl-1 избирательно взаимодействует с эндогенным Bak, но не с Bax, и подавляет апоптоз в клетках iBMK дикого типа и Bax-дефицитных, но не в Bak-дефицитных iBMK.( a ) Коиммунопреципитация эндогенного Bax или Bak с GFP-Bfl-1, эндогенным Bak или 2×Myc-Bfl-1 в клетках HeLa с обработкой TNFα/CHX или без нее для активации Bax и Bak. NT: нетрансфицированный. Линия разграничивает разные экспозиции одного и того же пятна. ( b ) Коиммунопреципитацию эндогенного Bax или Bak с 2×Myc-Bfl-1 по сравнению с FLAG-Mcl-1 проводили, как в панели ( a ). ( c ) Иммунопреципитация эндогенного Bak с помощью 2×Myc-Bfl-1, -Bfl-1ΔC или FLAG-Mcl-1. ( d ) Иммортализованные iBMK дикого типа, Bak-/-, Bax-/- и Bax-/-Bak-/- с двойным нокаутом, трансфицированные EGFP (заштрихованы), 2×Myc-Bfl-1 (черные), 2×Myc-Bfl-1ΔC (белый) или FLAG-Mcl-1 (точечный) обрабатывали STS в течение 24 ч или оставляли без обработки. Среднюю выживаемость в трех экспериментах определяли по исключению трипанового синего и нормализовали по эффективности трансфекции. CHX, циклогексимид; GFP, зеленый флуоресцентный белок; iBMK, бессмертная почка мышиного детеныша; STS, стауроспорин; TNFα, фактор некроза опухоли-α.

В противоположность этому GFP-Bfl-1 и 2×Myc-Bfl-1 сильно взаимодействовали с эндогенным Bak в необработанных клетках, подобно Mcl-1, а также с TNFα-активированным Bak (). Пониженные уровни Bak, иммунопреципитированного с 2×Myc-Bfl-1 в клетках, обработанных TNFα/CHX, согласуются с более низкими уровнями 2×Myc-Bfl-1 в этих условиях, что соответствует его обороту (Kucharczak et al. , 2005). ; Герольд и др. , 2006). Взаимодействие Bfl-1ΔC с Bak было значительно слабее, чем у Bfl-1 ().Таким образом, Bfl-1 ассоциирует с неактивной и активной формами эндогенного Bak, тогда как сниженное взаимодействие Bfl-1ΔC, скорее всего, является результатом его делокализации из митохондрий.

Избирательное взаимодействие Bfl-1 с эндогенным Bak является функциональным, поскольку он подавляет внутренний STS-индуцированный апоптоз в клетках эпителия почек бессмертных мышей дикого типа и Bax-дефицитных (iBMK), но не в Bak-дефицитных iBMK, которые экспрессируют Bax, но не Бак (; Degenhardt et al. , 2002). Два независимых клона iBMK каждого генотипа дали сходные результаты (не показаны).Поведение Bfl-1 было поразительно похоже на Mcl-1, который также взаимодействует с Bak, но не с Bax (Cuconati et al. , 2003; Gelinas and White, 2005; Willis et al. , 2005). Как и ожидалось, iBMK с двойным нокаутом, лишенные Bax и Bak, были очень устойчивы к апоптозу. Bfl-1ΔC был менее защитным, чем Bfl-1, в отношении Bax-/- и iBMK дикого типа, что согласуется с его сниженной связью с Bak. Как и в случае с Bfl-1, Bfl-1ΔC не способен подавлять апоптоз в клетках Bak-/-. Это показало, что селективное взаимодействие Bfl-1 с Bak, но не с Bax, коррелирует с подавлением Bak-, но не Bax-опосредованного апоптоза, подобно Mcl-1.

TNFα-индуцированный процессинг Bid в tBid приводит к активации Bax и Bak. Поскольку одновременная инактивация Bax и Bak необходима для противодействия смерти, вызванной TNFα (Degenhardt et al. , 2002), а Bfl-1 не взаимодействует с эндогенным Bax, мы спросили, связана ли его способность подавлять активацию Bax с взаимодействием с Bid и /или ставка. Сверхэкспрессия Bid-Myc или tBid-Myc коиммунопреципитировала GFP-Bfl-1 и Bfl-1ΔC (), как наблюдалось ранее (Werner et al. , 2002).Однако оба не смогли ассоциироваться с эндогенным Bid, несмотря на эффективную иммунопреципитацию 2×Myc-Bfl-1 и Bfl-1ΔC (10). Меньшее количество Bfl-1 по сравнению с Bfl-1ΔC во входных дорожках согласуется с конститутивным оборотом Bfl-1, который включает его С-конец (Kucharczak et al. , 2005; Herold et al. , 2006). Результаты заметно отличались, когда мы исследовали ассоциацию Bfl-1 с эндогенным tBid в клетках, обработанных TNFα/CHX, чтобы способствовать процессингу Bid в tBid (). Хотя эндогенный tBid трудно обнаружить из-за его короткого периода полувыведения (Breitschopf et al., 2000), было ясно видно взаимодействие с 2×Myc-Bfl-1 или Bfl-1ΔC, особенно при более длительном воздействии. В поддержку функционального взаимодействия Bfl-1 и Bfl-1ΔC подавляли апоптоз, индуцированный tBid, хотя Bfl-1ΔC был несколько менее эффективен, чем Bfl-1 (12). Это показывает, что подобно его дифференциальному взаимодействию с эндогенным Bak, но не с Bax, Bfl-1 избирательно связывается с эндогенным tBid, но не с Bid, и предполагает, что это взаимодействие важно для подавления внешнего апоптотического каскада, инициируемого TNFα.

Bfl-1 и Bfl-1ΔC избирательно взаимодействуют с эндогенным tBid, но не с Bid в клетках, обработанных TNFα, и подавляют апоптоз, индуцированный tBid. ( a ) Иммунопреципитация/вестерн-блоттинг GFP-Bfl-1 или -Bfl-1ΔC со сверхэкспрессией Bid-Myc или tBid-Myc в клетках HeLa. ( b ) Коиммунопреципитация эндогенного Bid или tBid с 2×Myc-Bfl-1 или -Bfl-1ΔC в клетках HeLa, обработанных только TNFα/CHX или CHX. Показана более длительная экспозиция. Звездочками отмечены позиции эндогенных Bid и tBid; над Bid в лизатах появлялась неспецифическая полоса.( c ) GFP-Bfl-1 или -Bfl-1ΔC подавляют вызванную tBid гибель клеток в клетках MCF-7, котрансфицированных tBid-FLAG или pcDNA3 вместе с CMV-β-gal. Показано среднее из трех экспериментов. ( d ) Модель, иллюстрирующая избирательное взаимодействие Bfl-1 с tBid и Bak для подавления TNFα- и Bak-зависимого апоптоза, а также сходство его механизма действия с Mcl-1. CHX, циклогексимид; GFP, зеленый флуоресцентный белок; TNFα, фактор некроза опухоли-α.

Обсуждение

Расхождение последовательностей между Bfl-1 и другими антиапоптотическими членами семейства Bcl-2 вызвало вопросы относительно механизма его действия. Мы демонстрируем, что в функциональном контексте живых клеток, где Bfl-1 ингибирует апоптоз, Bfl-1 избирательно связывается с эндогенными tBid и Bak, но не с Bid или Bax. В то время как Bfl-1 противодействовал активации Bax в ответ на внешнюю передачу сигнала о смерти с помощью TNFα, он не смог подавить Bax-опосредованную гибель клеток в ответ на внутреннюю передачу сигнала о смерти, которая не зависит от tBid в клетках Bak-/-, но эффективно блокировал STS-индуцированный апоптоз. в клетках Bax-/-, которые экспрессируют эндогенный Bak. Это указывает на то, что конститутивное взаимодействие Bfl-1 с Bak важно для подавления Bak-опосредованного апоптоза, тогда как его связь с tBid, скорее всего, ответственна за блокирование активации Bax в ответ на стимуляцию рецептора смерти.

Преобразование Bid в tBid усиливает сигнализацию рецептора смерти и приводит к активации Bax и Bak. В некоторых исследованиях предполагается, что tBid действует непосредственно на митохондрии, способствуя высвобождению цито C в отсутствие Bax и/или Bak (Epand et al. , 2002; Grinberg et al. , 2002). Однако исследования нокаута показали, что tBid, скорее всего, действует путем активации Bax и Bak, поскольку клетки, лишенные обоих факторов, устойчивы к апоптозу (Wei et al. , 2001; Degenhardt et al., 2002). Наши данные подтверждают идею о том, что ассоциация Bfl-1 с tBid, скорее всего, ответственна за подавление активации Bax, поскольку Bfl-1 не смог связать эндогенный Bax в клетках, обработанных TNF. Это согласуется с сообщениями, показывающими, что, хотя Bcl-2 и Bcl-x _L могут напрямую ассоциироваться с Bax, их взаимодействие с tBid наиболее важно для их защитной функции в каскаде TNF (Cheng et al. , 2001; Werner ). и др. , 2002; Yi и др. , 2003).

Важно отметить, что подобно Mcl-1, Bfl-1 взаимодействует с Bak-опосредованным апоптозом и подавляет его, и это взаимодействие не зависит от активации Bak (Cuconati et al. , 2003; Willis et al. , 2005). Недавняя работа предполагает, что они также демонстрируют поразительно сходное сродство к пептидам Bh4 из некоторых факторов, содержащих только Bh4, которое отличается от такового у Bcl-2, Bcl-x _L и Bcl-w (Chen et al. , 2005), хотя некоторые обнаружили иное (Certo et al. , 2006).Наш вывод о том, что Bfl-1 физически и функционально взаимодействует с Bak в живых клетках, отличается от других, которым не удалось увидеть взаимодействие между , транслируемым in vitro Bfl-1, и Bak в присутствии митохондрий печени мыши (Werner et al. , 2002). ). Поскольку рекомбинантный tBid был включен в эти анализы, а ассоциация tBid с Mcl-1 может вытеснять Bak из комплексов Mcl-1-Bak (Clohessy et al. , 2006), tBid также может диссоциировать Bfl-1 от Bak, тем самым препятствуя обнаружению комплексов Bfl-1-Bak в этих анализах.

Поскольку гидрофобный С-конец мультидоменных белков семейства Bcl-2 участвует в локализации мембраны, а заряженные остатки присутствуют на С-конце Bfl-1, Bfl-1 может быть белком периферической мембраны, который слабо связан с митохондриями и может зависеть от на взаимодействие с митохондриальными белками для локализации в этой органелле. Хотя мы не исключаем возможности того, что Bfl-1ΔC сохраняет некоторую локализацию в митохондриях, его измененная локализация согласуется с его сниженной ассоциацией с эндогенным Bak, которая постоянно обнаруживается в митохондриях, и его сниженной способностью эффективно подавлять Bak-зависимый апоптоз. Это может объяснить, почему в недавней работе с использованием Bfl-1ΔC-подобной формы A1, лишенной 20 C-концевых аминокислот, не удалось обнаружить взаимодействие с Bak (Chen et al. , 2005; Willis et al. , 2005). ). Ослабленная ассоциация Bfl-1ΔC с Bak может также прояснить, почему делеция C-конца Bfl-1 снижает его защитную активность в отношении p53-индуцированного апоптоза, в котором Bak играет важную роль (D’Sa-Eipper and Chinnadurai, 1998). В совокупности эти находки показывают, что эффективное взаимодействие Bfl-1/Bak может быть важным средством для Bfl-1 противодействовать внутренней передаче сигналов смерти, которая зависит от Bak и не передает сигналы через tBid.

В целом наши данные показывают, что механизм действия Bfl-1 подобен действию Mcl-1, который изолирует Bak в неактивных комплексах и взаимодействует с tBid для подавления апоптоза, опосредованного рецептором смерти (; Oltvai et al. , 1993; Perez and White, 2000; Cuconati and White, 2002; Cuconati и др. , 2002, 2003; Clohessy и др. , 2006). Хотя Bfl-1 и Mcl-1 используют сходные средства для подавления апоптоза, они, вероятно, действуют неповторяющимся образом в разных клетках и в ответ на разные стимулы, поскольку они находятся под разным транскрипционным контролем, а Mcl-1 не является Мишень NF-κB (Michels et al., 2005). Bfl-1 сверхэкспрессируется во многих опухолях человека, в том числе в некоторых, в которых конститутивная активация NF-κB необходима для выживания и химиорезистентности. Таким образом, функциональное взаимодействие Bfl-1 с tBid и Bak может способствовать его роли в онкогенезе и резистентности к терапии. В совокупности эти исследования позволяют по-новому взглянуть на механизмы, с помощью которых Bfl-1 противодействует внешним и внутренним каскадам сигналов смерти, и позволяют предположить, что подходы к специфической блокировке взаимодействия Bfl-1 с tBid и/или Bak могут улучшить реакцию клеток, экспрессирующих Bfl-1. опухолевых клеток к противораковому лечению. Это может быть важно, поскольку ингибирование Mcl-1 необходимо для сенсибилизации некоторых опухолей к низкомолекулярным миметикам Bh4 ABT-737, которые противодействуют Bcl-x _L , Bcl-2 и Bcl-w (Konopleva et al. ). , 2006; Letai, 2006; van Delft и др. , 2006). Если Bfl-1 представляет собой NF-κB-индуцированный заменитель Mcl-1, антагонистическая функция Bfl-1 может быть необходима для терапии рака и, возможно, является одним из средств, с помощью которых ингибиторы NF-κB провоцируют апоптоз раковых клеток.

Материалы и методы.

Иммунофлуоресценция.

Иммунопреципитация

Клетки HeLa, котрансфицированные FLAG-Bax, Bid-Myc или tBid-Myc, были дополнены ингибитором каспаз z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK (zVAD-fmk). Взаимодействие с эндогенными факторами анализировали в экстрактах CHAPS из клеток HeLa, обработанных TNFα (10 нг мл ^-1 ) плюс CHX (30 мкг мл ^-1 ) или только CHX в течение 6 ч с использованием анти-FLAG, -Myc, -Bak или -Bax-loop антитела и иммуноблотинг для Myc, GFP, BaxNT, BakNT, BaxN20 или Bid.

Анализы апоптоза

Иммортализованные клеточные линии BMK, трансфицированные усиленным зеленым флуоресцентным белком (EGFP), Bfl-1, Bfl-1ΔC или Mcl-1, не обрабатывали или обрабатывали STS (1.5 мкМ) в течение 24 часов. Выживаемость определяли по исключению трипанового синего и нормализовали по эффективности трансфекции. Определяли выживаемость β-галактозидазо-положительных клеток MCF-7, котрансфицированных GFP-Bfl-1 или -Bfl-1ΔC и tBid-FLAG или pcDNA3 вместе с pCMV-β-gal.

Дополнительные детали эксперимента доступны в дополнительной информации.

Благодарности

Мы благодарим R Sundararajan, D Perez и N Gupta за обсуждения. Эта работа была поддержана грантом NIH CA083937, Фондом Шарлотты Гейер и Фондом UMDNJ.MJS был частично поддержан грантом GM08360 для подготовки докторантов NIH.

Ссылки

• Breitshopf K, Zeiher AM, Dimmeler S. Опосредованная убиквитином деградация проапоптотически активной формы bid. Функциональное последствие индукции апоптоза. Дж. Биол. Хим. 2000; 275:21648–21652. [PubMed] [Google Scholar]
• Certo M, Del Gaizo Moore V, Nishino M, Wei G, Korsmeyer S, Armstrong SA, et al. Митохондрии, инициированные сигналами смерти, определяют клеточную зависимость от антиапоптотических членов семейства BCL-2.Раковая клетка. 2006; 9: 351–365. [PubMed] [Google Scholar]
• Chen L, Willis SN, Wei A, Smith BJ, Fletcher JI, Hinds MG, et al. Дифференциальное нацеливание на белки Bcl-2, способствующие выживанию, с помощью их лигандов, состоящих только из Bh4, делает возможной комплементарную апоптотическую функцию. Мол Ячейка. 2005; 17: 393–403. [PubMed] [Google Scholar]
• Cheng EH, Wei M, Weiler S, Flavell RA, Mak TW, Lindsten T, et al. BCL-2, BCL-XL изолируют молекулы, содержащие только домен Bh4, предотвращая BAX- и BAK-опосредованный митохондриальный апоптоз. Мол Ячейка.2001; 8: 705–711. [PubMed] [Google Scholar]
• Clohessy JG, Zhuang J, de Boer J, Gil-Gomez G, Brady HJ. Mcl-1 взаимодействует с укороченным Bid и ингибирует его индукцию высвобождения цитохрома c и его роль в рецептор-опосредованном апоптозе. Дж. Биол. Хим. 2006; 281:5750–5759. [PubMed] [Google Scholar]
• Cory S, Huang DC, Adams JM. Семейство Bcl-2: роль в выживании клеток и онкогенезе. Онкоген. 2003; 22:8590–8607. [PubMed] [Google Scholar]
• Куконати А., Дегенхардт К., Сундарараджан Р., Аншель А., Уайт Э.Bak и Bax ограничивают репликацию аденовирусов посредством индукции апоптоза. Дж Вирол. 2002; 76: 4547–4558. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Cuconati A, Mukherjee C, Perez D, White E. Реакция на повреждение ДНК и разрушение MCL-1 инициируют апоптоз в инфицированных аденовирусом клетках. Гены Дев. 2003; 17: 2922–2932. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Cuconati A, White E. Вирусные гомологи Bcl-2: роль апоптоза в регуляции вирусной инфекции. Гены Дев.2002; 16: 2465–2478. [PubMed] [Google Scholar]
• D’Sa-Eipper C, Chinnadurai G. Функциональная диссекция Bfl-1, гомолога Bcl-2: антиапоптозная активность, сотрудничество с онкогенами и пролиферация клеток. Онкоген. 1998;16:3105–3114. [PubMed] [Google Scholar]
• Дегенхардт К., Сундарараджан Р., Линдстен Т., Томпсон С., Уайт Э. Бакс и Бак независимо способствуют высвобождению цитохрома С из митохондрий. Дж. Биол. Хим. 2002; 277:14127–14134. [PubMed] [Google Scholar]
• Desagher S, Osen-Sand A, Nichols A, Eskes R, Montessuit S, Lauper S, et al.Индуцированное Bid конформационное изменение Bax отвечает за высвобождение митохондриального цитохрома c во время апоптоза. Джей Селл Биол. 1999; 144: 891–901. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Epand RF, Martinou JC, Fornallaz-Mulhauser M, Hughes DW, Epand RM. Апоптотический белок tBid способствует утечке, изменяя кривизну мембраны. Дж. Биол. Хим. 2002; 277:32632–32639. [PubMed] [Google Scholar]
• Gélinas C, White E. Белки, содержащие только Bh4, в контроле: специфичность регулирует MCL-1 и BAK-опосредованный апоптоз.Гены Дев. 2005;19:1263–1268. [PubMed] [Google Scholar]
• Гринберг М. , Сариг Р., Зальцман Ю., Фрумкин Д., Грамматикакис Н., Реувени Э. и др. tBID гомоолигомеризуется в митохондриальной мембране, вызывая апоптоз. Дж. Биол. Хим. 2002; 277:12237–12245. [PubMed] [Google Scholar]
• Grumont RJ, Rourke IJ, Gerondakis S. Rel-зависимая индукция транскрипции A1 необходима для защиты B-клеток от апоптоза, вызванного лигированием антигенных рецепторов. Гены Дев. 1999; 13:400–411. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Herold MJ, Zeitz J, Pelzer C, Kraus C, Peters A, Wohlleben G, et al.Стабильность и антиапоптотическая функция А1 контролируются его С-концом. Дж. Биол. Хим. 2006; 281:13663–13671. [PubMed] [Google Scholar]
• Holmgreen SP, Huang DC, Adams JM, Cory S. Выживаемость гомологов Bcl-2 Bcl-w и A1 лишь частично коррелирует с их способностью связывать проапоптотических членов семейства. Смерть клеток 1999; 6: 525–532. [PubMed] [Google Scholar]
• Хсу Ю.Т., Юле Р.Дж. Bax в тимусе мышей представляет собой растворимый мономерный белок, который демонстрирует различные конформации, индуцированные детергентом. Дж. Биол. Хим. 1998; 273:10777–10783. [PubMed] [Google Scholar]
• Karsan A, Yee E, Harlan JM, et al. Гибель эндотелиальных клеток, индуцированная фактором некроза опухоли-альфа, ингибируется членом семейства Bcl-2, A1. Дж. Биол. Хим. 1996; 271:27201–27204. [PubMed] [Google Scholar]
• Коноплева М., Контрактор Р., Цао Т., Самудио И., Руволо П.П., Китада С. и др. Механизмы чувствительности и устойчивости к апоптозу к миметику Bh4 ABT-737 при остром миелоидном лейкозе. Раковая клетка. 2006; 10: 375–388.[PubMed] [Google Scholar]
• Kucharczak JF, Simmons MJ, Duckett CS, Gelinas C. Опосредованный конститутивными протеасомами оборот Bfl-1/A1 и его процессинг в ответ на активацию рецептора TNF в клетках FL5.2 pro-B convert это в фактор предсмерти. Смерть клеток 2005; 12:1225–1239. [PubMed] [Google Scholar]
• Kuwana T, Bouchier-Hayes L, Chipuk JE, Bonzon C, Sullivan BA, Green DR, et al. Домены Bh4 либо сенсибилизируют, либо активируют митохондриальный апоптоз, выступая в качестве прототипа противораковой терапии. Мол Ячейка. 2005; 17: 525–535. [PubMed] [Google Scholar]
• Lee HH, Dadgostar H, Cheng Q, Shu J, Cheng G. Опосредованная NF-kappaB активация Bcl-x и Bfl-1/A1 необходима для передачи сигналов выживания CD40 в B-лимфоцитах. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:9136–9141. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Летай А. Восстановление смертного приговора раку. Раковая клетка. 2006; 10: 343–345. [PubMed] [Google Scholar]
• Letai A, Bassik MC, Walensky LD, Sorcinelli MD, Weiler S, Korsmeyer SJ.Отдельные домены Bh4 либо сенсибилизируют, либо активируют митохондриальный апоптоз, выступая в качестве прототипа противораковой терапии. Раковая клетка. 2002; 2: 183–192. [PubMed] [Google Scholar]
• Michels J, Johnson PW, Packham G. Mcl-1. Int J Biochem Cell Biol. 2005; 37: 267–271. [PubMed] [Google Scholar]
• Нгуен М., Миллар Д.Г., Йонг В.В., Корсмейер С.Дж., Шор Г.К. Нацеливание Bcl-2 на наружную мембрану митохондрий с помощью COOH-концевой сигнальной якорной последовательности. Дж. Биол. Хим. 1993; 268:25265–25268. [PubMed] [Google Scholar]
• Олтвай З.Н., Миллиман С.Л., Корсмейер С.Дж.Bcl-2 гетеродимеризует in vivo с консервативным гомологом Bax, который ускоряет запрограммированную гибель клеток. Клетка. 1993; 74: 609–619. [PubMed] [Google Scholar]
• Перес Д., Уайт Э. ФНО-альфа сигнализирует об апоптозе через конформационное изменение Bax, зависящее от бид, которое ингибируется E1B 19K. Мол Ячейка. 2000; 6: 53–63. [PubMed] [Google Scholar]
• Sedlak TW, Oltvai ZN, Yang E, Wang K, Boise LH, Thompson CB, et al. Несколько членов семейства Bcl-2 демонстрируют селективную димеризацию с Bax.Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92: 7834–7838. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Somogyi RD, Wu Y, Orlofsky A, Prystowsky MB. Временная экспрессия члена семейства Bcl-2, A1-a, приводит к ядерной локализации и устойчивости к стауроспорин-индуцированному апоптозу. Смерть клеток 2001; 8: 785–793. [PubMed] [Google Scholar]
• van Delft MF, Wei AH, Mason KD, Vandenberg CJ, Chen L, Czabotar PE, et al. Миметик Bh4 ABT-737 нацеливается на селективные белки Bcl-2 и эффективно индуцирует апоптоз через Bak/Bax, если Mcl-1 нейтрализуется.Раковая клетка. 2006; 10: 389–399. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wang CY, Guttridge DC, Mayo MW, Baldwin AS., Jr NF-kappaB индуцирует экспрессию гомолога Bcl-2 A1/Bfl-1 для преимущественного подавления индуцированного химиотерапией апоптоз. Мол Селл Биол. 1999;19:5923–5929. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wei MC, Lindsten T, Mootha VK, Weiler S, Gross A, Ashiya M, et al. tBID, мембранно-направленный лиганд смерти, олигомеризует BAK с высвобождением цитохрома c .Гены Дев. 2000;14:2060–2071. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wei MC, Zong WX, Cheng EH, Lindsten T, Panoutsakopoulou V, Ross AJ, et al. Проапоптотические BAX и BAK: необходимые ворота к митохондриальной дисфункции и гибели. Наука. 2001; 292: 727–730. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Werner AB, de Vries E, Tait SWG, Bontjer I, Borst J. Член семьи Bcl-2 секвестрирует Bfl-1/A1 укорочено, чтобы предотвратить его сотрудничество с проапоптотическим Bak или Бакс.Дж. Биол. Хим. 2002; 277: 22781–22788. [PubMed] [Google Scholar]
• Willis SN, Chen L, Dewson G, Wei A, Naik E, Fletcher JI, et al. Проапоптотический Bak секвестрируется Mcl-1 и Bcl-xL, но не Bcl-2, до тех пор, пока не будет вытеснен белками, состоящими только из Bh4. Гены Дев. 2005;19:1294–1305. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Yi X, Yin XM, Dong Z. Ингибирование Bid-индуцированного апоптоза с помощью Bcl-2. Инсерция tBid, транслокация Bax и олигомеризация Bax/Bak подавлены. Дж. Биол. Хим. 2003; 278:16992–16999.[PubMed] [Google Scholar]
• Zhang H, Cowan-Jacob SW, Simonen M, Greenhalf W, Heim J, Meyhack B. Структурная основа Bfl-1 для его взаимодействия с Bax и антиапоптотического действия в клетках млекопитающих и дрожжей . Дж. Биол. Хим. 2000; 275:11092–11099. [PubMed] [Google Scholar]
• Zong WX, Edelstein LC, Chen C, Bash J, Gélinas C. Гомолог Bcl-2 для выживания Bfl-1/A1 является прямой мишенью транскрипции NF-κB, который блокирует апоптоз, индуцированный TNFα. . Гены Дев. 1999; 13: 382–387. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Можете ли вы оспорить вмешательство в передачу в НФЛ? Правила повторов и многое другое об OPI, DPI в 2020 году

Возможно, есть люди, которые тоскуют по дням, когда помехи при пасах в атаке и защите были фолами, подпадающими под действие системы просмотра повторов НФЛ.Некоторым, как говорится, просто нравится смотреть, как горит мир.

По ходу сезона НФЛ 2020 года не трудитесь кричать в телевизор, чтобы тренер вашей любимой команды бросил свой флаг вызова или чтобы официальные лица игры направились к монитору мгновенного повтора, когда вы видите то, что, по вашему мнению, пропущено. передать вызов помех. Эти штрафы больше не подлежат пересмотру в НФЛ.

ДЕКУРСИ: Как НФЛ потерпела неудачу в обзоре повтора PI

Сага о просмотре повтора помех НФЛ была катастрофическим,  годичным экспериментом, родившимся из печально известного пропущенного звонка в игре чемпионата NFC 2019 года. Такая досадная ошибка судейства оказала как внешнее, так и внутреннее давление на лигу, чтобы попытаться избежать подобных вопиющих пропущенных вызовов в будущем, и простым (хотя и ошибочным) решением было сделать фолы подлежащими пересмотру.

Некоторые говорят, что в 2019 году НФЛ не увенчалась успехом в проверке воспроизведения повторов передач с помехами, потому что с самого начала была обречена из-за ошибочной логики. Другие говорят, что эксперимент мог бы сработать, если бы судейский отдел НФЛ решил научиться эффективно использовать проверку PI и не отказывался от этого процесса в течение года.

Несмотря на это, помехи при пасе больше не входят в число розыгрышей/фолов, подпадающих под действие системы просмотра повторов НФЛ. Ниже приведены причины почему.

Можете ли вы оспорить пропуск прохода в НФЛ?

Нет, больше нет. Запросы и невызовы вмешательства в наступательных и защитных пасах подпадали под действие системы проверки повторов НФЛ только в течение одного сезона (2019 г. ). По сути, лига дала этому дополнению к своей сводке правил годовую пробную версию, и вопрос о том, станет ли оно постоянным правилом, будет решаться в 2020 году.

Когда НФЛ пришло время решить, оставить ли вмешательство в пас в качестве подлежащего пересмотру решения, ответом было решительное нет. Фактически, продление проверки PI даже не рассматривалось как вариант.

«Никто снова не выдвигает обзор OPI / DPI, так что это умирает естественной смертью», — сказал член комитета по соревнованиям НФЛ и президент Falcons Рич Маккей на радио SiriusXM NFL во время весеннего собрания владельцев НФЛ.

Отсутствие голосования означало, что поправка к своду правил НФЛ, позволяющая пересматривать вмешательство в пас, будет просто удалена.Что неудивительно, учитывая, что годичный эксперимент был в значительной степени беспорядочным.

«По моему мнению, мы пытались применить то, чего всегда боялись, — сказал Маккей. «Мы не знали, каков будет общий результат, но мы всегда боялись включить в повтор полностью субъективную игру. Большинство повторов объективны, и я имею в виду, что это линия». Пересек самолет или нет? Коснулся ли мяч земли или нет? Был ли он в двух футах или нет? Здесь задействовано много объективных линий, и это объективный обзор.

«Когда мы переходим к субъективному, то есть: «Было ли этого достаточно для фола? Достаточно ли он его схватил? Было ли достаточно ограничения?» Мы знали, что будут проблемы, потому что ваша субъективность и моя субъективность в отношении той или иной рассматриваемой игры могут легко различаться.То, был ли мяч пойман или не пойман — мы можем не согласиться один раз из 100 (раз), но примерно в 99 процентах случаев.

«Это неправда в субъективном мире, поэтому я думаю, когда вы сделали то, что сделали мы, то есть попытались поймать эту действительно вопиющую грандиозную игру и поставить этот стандарт ясности и очевидности, даже тогда, я думаю, вы добавляете субъективный стандарт к субъективной игре, и я думаю, что мы поставили перед собой задачу не прийти к соглашению о результатах, и я думаю, что это проявилось в течение года. »

В дополнение к проблемам субъективности, проверка НФЛ, отказавшаяся от PI, подтвердила, что лига годом ранее просто слишком остро отреагировала на отсутствие вызова, который стоил Святым поездки на Суперкубок 53.

Мы не можем винить НФЛ за Принятие мер после подачи углового «Рэмс» Никелла Роби-Коулмана, блистательного ресивера «Святых» Томмили Льюиса, не вызвали из-за очевидной помехи пасу, учитывая, что судейская ошибка произошла в такой решающий момент в игре чемпионата NFC.Но, как мы писали здесь ранее , лига решила не ту проблему.

Проблема была не в том, что такой вопиющий пропущенный звонок нельзя было просмотреть. Проблема была в том, что такой простой звонок был пропущен.

Майк ДеКурси из SN считает, что эксперимент с проверкой PI мог бы сработать, если бы отдел судейства НФЛ подошёл к процессу более добросовестно.

«В течение сезона 2019 года тренеры лиги оспаривали вызовы о помехах при передаче 81 раз», — написал ДеКурси в мае, когда правило было отменено. «Они выиграли эти испытания 13 раз.Это 16 процентов успеха. Это может показаться мечтательным для Майка Томлина из «Стилерс», который провел сезоны 2017 и 18 годов, не справившись ни с одной задачей, но средний показатель лиги по всем обзорам повторов за 2019 год составил 47 процентов.

«Тренеры добились столь незначительного успеха в первой половине прошлого сезона — всего пять разворотов из 56 попыток вызова за девять недель — что они разочаровались даже в том, чтобы подумать о том, чтобы потратить один из двух выделенных им повторных вызовов на споры о помехах при передаче.

«Трудно интерпретировать это как что-либо иное, кроме как диктовать политику в штаб-квартире… «Это уходит, потому что определенные люди, очевидно, хотели, чтобы это исчезло. Он потерпел неудачу не сам по себе, а как продукт бескорыстного исполнения. Эксперимент не с треском провалился. Экспериментаторы так и сделали.»

Правила помех при пасах НФЛ

Даже в тех случаях, когда можно было пересматривать вызовы или отказы от паса в нападении и защите, официальный язык, касающийся фолов в своде правил НФЛ, не изменился. Он остается таким же и в 2020 году.

Штрафы за помехи при пасе защиты по-прежнему даруют нападающей команде первый даун с точки фола, а если PI также является персональным фолом, применяется дополнительный 15-ярдовый штраф. Штрафы за помехи при передаче в нападении по-прежнему стоили команде 10 ярдов от предыдущей точки.

Прямо из свода правил НФЛ, ниже приведены стандарты, которые лига использует для определения помех при передаче.

Действия, представляющие собой помеху при пасе, включают, но не ограничиваются:

• Контакт игрока, не играющего в мяч, который ограничивает возможность соперника поймать мяч;
• Игра через спину соперника с целью игры с мячом;
• Захват руки(-ей) соперника таким образом, что ограничивает его возможность поймать пас;
• Протягивание руки через тело соперника, что ограничивает его возможность поймать передачу, и независимо от того, играет ли игрок, совершающий такое действие, с мячом;
• Отрезание пути соперника путем контакта с ним, без игры в мяч;
• Захват соперника хуком в попытке добраться до мяча таким образом, что он заставляет тело соперника повернуться до прибытия мяча; или
• Начало контакта с противником путем толкания или отталкивания, что создает разделение.

В своде правил НФЛ также перечислены «разрешенные действия обеих команд, когда мяч находится в воздухе».

Другими словами, нижеследующее является честной игрой и не считается вмешательством в пас.

• Случайный контакт руками, руками или телом соперника, когда оба игрока борются за мяч или ни один из игроков не ищет мяч. Если есть какие-либо сомнения в том, что контакт был случайным, решение не должно вмешиваться.
• Непреднамеренное спутывание стоп, когда оба игрока играют в мяч или ни один из игроков не играет в мяч.
• Контакт, который обычно считается помехой при передаче, но передача явно не может быть перехвачена вовлеченными игроками, за исключением случаев, связанных с блокировкой поля нападением.
• Возложение руки на соперника, которое не ограничивает его в попытке сыграть с мячом.
• Контакт игрока, занявшего позицию над соперником в попытке поймать мяч.

.

Добавить комментарий Отменить ответ

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Комментарий *

Имя *

Email *

Сайт