Размер аватарки для группы Вконтакте
В данном посте мы в очередной раз поговорим о новом дизайне Вконтакте, а именно – о размерах картинок. Если быть еще более точным, то в этой публикации пойдет речь о размере аватарки для группы Вконтакте. Предыдущая публикация на нашем ресурсе socprka.ru была посвящена также размерам картинок, но там мы разбирали вопрос о размерах картинок для постов Вконтакте. Теперь настал черед аватарок для группы ВК. Что же такое, эта самая аватарка группы Vkontakte? Аватарка – это картинка профиля группы. Можно сказать, что ава – это изображение, своеобразный логотип или, если угодно, подпись вашего сообщества. Многие администраторы групп немного недооценивают важность дизайна: картинок, аватарок, обложки группы. И делают они это совершенно напрасно. Как показывает практика, качественный и красивый дизайн группы ВК – это тоже важный элемент для привлечения участников. Наше агентство, кстати, оказывает услугу разработки качественных дизайнов для сообществ, с учетом всех рекомендаций по размерам элементов. Для заказа данной опции, перейдите на страничку: «//socprka.ru/oformlenie-dizajn-gruppy-vkontakte.php» и выберите один из доступных тарифов.
Если вы хотите сами сделать неповторимую аватарку для группы ВК, прочитайте эту публикацию. Допустим, у вас уже есть ава, тогда вы должны знать, как ее установить и в дальнейшем настроить ее отображение. Чтобы это провернуть, потребуется:
- Войти на страницу вашего сообщества.
- Найти справа пустую область для фото.
- Кликнуть по ссылке с надписью: «Загрузить фотографию», как показано на верхнем изображении.
- После этого откроется окно, где вы должны будете загрузить картинку (будущую аватарку).
- Далее фотография загрузится.
- Теперь нужно сохранить и продолжить, как показано на нижнем скриншоте.
Какой размер аватарки в Вконтакте для группы лучше выбрать
После выполнения всех описанных манипуляций откроется еще одно окно, в котором вы увидите все варианты отображения аватарки Вконтакте: в новостях, списках групп и в комментах. То есть, вам нужно мышью выделить область на загруженном снимке так, чтобы изображение было распознаваемым, удачно подогнанным по размеру, и чтобы оно максимально отображало ваше сообщество. После выделения и масштабирования нужно сохранить все проделанные изменения, кликнув по соответствующей кнопке (смотри скриншот внизу).
Очевидно, социальная сеть сама подгонит размеры вашего изображения под стандарты, но, все же, юзеры довольно часто не знают, какой размер аватарки лучше выбрать для группы в Вконтакте. Можно выбирать любые размеры, которые вкладываются в определенные рамки. Качество также очень важно. Оно тоже может привлекать или отпугивать потенциальных подписчиков, число которых, кстати, вы можете легко увеличить, перейдя по ссылке. Вернемся к размерам аватарки. Главное, чтобы фотография не была слишком маленькая. При загрузке снимков, размер которых меньше 200 пикселей или более 7000 пикселей по каждой стороне система выдаст предупреждение, что не позволит вам выполнить загрузку такой картинки на аву группы ВК.
Размер аватарки для группы Вконтакте в 2017 году
Дизайн, как и функционал ВК, постоянно подвергается изменениям, поэтому нужно всегда быть в курсе подобных перемен. Оптимальные размеры картинок во Вконтакте тоже постоянно менялись. Нам нужно знать, какой размер аватарки для группы Вконтакте актуален в 2017 году. Кто знает, может быть в 2018 году все изменится, но на сегодняшний день точно можно сказать, что максимальные размеры картинки для аватарки в группе – это 200 на 500 пикселей. Это все прописано в ответах на частые вопросы в самом ВК (смотрите скрин чуть ниже). К слову, там же говорится, что для авы можно выбрать и большее изображение, но чтобы увидеть его в полный рост, нужно по нему кликнуть.
На нижнем скриншоте вы можете увидеть все ограничения, которые Вконтакте накладывает на фотографии. Как видно из рисунка, минимальный размер аватарки – это круг диаметром 200 точек, то есть сама картинка должна быть не меньше, чем 200 на 200 точек. Есть также и верхний предел на размеры загружаемых картинок – сумма пикселей высоты и ширины изображения не должен превышать отметку 14000 точек.
Описание производственной модели управления на базе AVA ERP
Установка для руководителя:
Можно сколько угодно совещаться, устраивать летучки и прочие пылесосы времени. Это просто потеря времени, как руководства, так и сотрудников. Все равно вы на этих планерках ничего толком не выясните. А даже, если и выясните, то уверенными быть не сможете, что это все действительно так, как вам говорят. Потеря времени — это потеря денег. Чем больше совещаний, тем меньше эффективности. Количество совещаний — индикатор эффективности предприятия. Чем их больше, тем ниже эффективность.
Наша модель управления производством построена на базе Теории Ограничений. Это индикаторы, которые показывают состояние дел на каждом участке вашего предприятия. Индикаторы — это рабочие места сотрудников компании. Очередь закупок, очередь входного контроля, очередь платежей, входной контроль, очередь изолятора, очереди производства и очереди ОТК. Шесть основных индикаторов. Задача руководителя — это контроль над ключевыми позициями заказов. Ключевая позиция — это самое проблемное место заказа. Вмешивайтесь только в те ситуации, где ключевая позиция находится в красно-черной зоне. Чтобы в компании было все хорошо — добейтесь отсутствия в заказах красно-черных ключевых позиций.
Все начинается с разработки дерева изделия. Кто-то заносит номенклатуру, которую мы планируем продавать и формирует заявку на разработку дерева. Конструктора + технологи совместными усилиями делают дерево и закрывают заявку на его разработку. Кто надо получает об этом уведомление и может это дерево утвердить (если это необходимо). Все, товар можно продавать. Если в будущем что-то в дереве изменится (например, технолог что-то изменит), то система сформирует извещение об изменении, чтобы конструктор внес соответствующие изменения в КД.
Перед занесением заказа можно попросить систему спрогнозировать дату отгрузки. Система встроит ваш заказ в текущие графики работ, оценит текущие запасы, текущее положение дел в закупках, посмотрит текущие очереди на каждом производственном участке и скажет, на какую дату можно принимать заказ.
Менеджер выписывает счет, заносит туда товар, указывает количество и дату, когда он хотел бы это отгрузить. Запускает счет в работу, если у клиента постоплата. Если предоплата, то система сама запустит счет после того, как вы загрузите банковскую выписку. Система копирует конструкторское дерево в заказ и начинает с ним работать. Решает, нужно ли что-то делать по этому счету, и если нужно, то что конкретно. Оценивает ситуацию, проводит замены на аналоги, если это требуется и т.д. Все, что требуется сделать по этому счету, встраивается в текущие графики работ на всех рабочих местах.
Вот так выглядит дерево изделия в счете. Это, так называемое, технологическое дерево. Оно может отличаться от конструкторского. Например тем, что здесь часть элементов может быть заменена на аналоги. Разумеется автоматически.
Картинки кликабельны.
Для руководителей проектов и менеджеров, отвечающих за конкретные заказы, это удобное место, где можно посмотреть состояние дел в заказе. Более того, система не просто показывает состояние дел вплоть до каждого винта, но еще и приоритет, показывая какие позиции являются наиболее важными. Но ключевые пользователи (закупки, ОТК, склад, производство и т.д.) здесь не работают. Все пользователи работают в своих графиках работы, в своих очередях. Не будет же менеджер по закупкам лазить по каждому счету и выяснять, что он там должен купить.
Хотя именно так и работают на многих предприятиях. Берут КД по каждому заказу и выписывают оттуда покупнину, затем рисуют себе в Excel потребность, где отмечают, что уже заказали поставщикам, причем заказывают не то, что надо, а то, что надо не заказывают. Ну, вы знаете, как это происходит.
Адский труд, отнимающий огромное количество времени и порождающий кучу ошибок.
Вот картинка понагляднее. Здесь много чего надо покупать и система по каждой позиции показывает, как с ней обстоят дела. Менеджер, ведущий проект, просто открывает свой счет и видит, где и какие проблемы с его изделием. Красные записи — это нехорошо. Надо жаловаться в соответствующие инстанции.
Здесь нет сортировки по приоритету, потому что это не график закупок, это конкретное изделие.
В системе есть несколько ключевых рабочих мест, по которым собственно и происходит управление всеми процессами производства. Я называю эти рабочие места «индикаторами». Руководство постоянно наблюдает за состоянием дел во всех индикаторах и вмешивается тогда, когда индикатор уходит в красную зону. Если этого не происходит, значит у нас все спокойно.
- очередь закупок
- очередь ожидания прихода
очередь входного контроля- входной контроль (ВК)
- очередь изолятора
- очередь производства (как по всему производству, так и по каждому участку)
- очередь оплат
Вот так выглядит очередь закупок. Фактически это рабочее место менеджеров по закупкам. Именно отсюда они формируют счета поставщиков. Смотрят сюда, понимают, чем заниматься, звонят поставщикам и заказывают. Таким образом появляются счета поставщиков. В этой очереди одновременно находятся как позиции под конкретные заказы, так и позиции для пополнения буферов запаса.
А вот это очередь ожидания. Это позиции, которые уже заказаны поставщикам. Чтобы ничего не прошляпить система и тут строит очередь ожидания и менеджмент за ней тоже наблюдает. Это важно, если поставщик, которому что-то заказали, начинает динамить. И чтобы не пропустить этот момент, смотрим постоянно сюда тоже. Как только какие-то позиции начали краснеть, сразу начинаем паниковать и жаловаться в соответствующие инстанции. Если счет поставщика оплачен, то инстанция — это сам поставщик, если не оплачен, то инстанция — это наша финансовая служба.
Затем менеджеры заносят заявки на оплаты этих счетов. В этих заявках точно такой же приоритет. Таким образом финансисты тоже понимают, что оплачивать в первую очередь, что потом. Это уже очередь платежей. То есть платим тоже не по интуиции, а с математической точностью. Сначала самый важный платеж, затем второй и т.д.
Разумеется все эти приоритеты динамичны. Верней, почти динамичны. Если ситуация как-то изменится, то система перестроит все графики и переориентирует все ресурсы на более важный заказ. А ситуация точно изменится, появятся новые заказы, перенесут старые, как-то изменятся складские запасы и т.д. По практике все графики пересчитывают один-два раза в день.
Очередь входного контроля — это список того, что нужно передать на входной контроль. Этот список может содержать сотни и даже тысячи записей. Поэтому здесь чрезвычайно важно понимать, что необходимо передать в первую очередь, что во вторую и т.д.
Передача на входной контроль происходит разумеется непосредственно из очереди. Инженер ОТК из очереди заносит заявку на ВК и эта позиция разрешается к отдаче с «зоны приема». После этого инженер ОТК идет на склад «зона приема» и ему отдают по заявке то, что он запросил.
Однако здесь есть не только приоритет, показывающий важность проверки той или иной позиции. Здесь еще есть колонка «Можно», которая говорит о том, а есть ли смысл проверять эту позицию сейчас. Если по результатам проверки вы все равно не сможете запустить производственное задание, то система в колонке «Можно» покажет 0. Не стоит проводить входной контроль, если в этом нет смысла, даже если очень высокий приоритет. Однако в некоторых случаях это делать стоит, тут надо смотреть по ситуации. Система не запрещает. Если на входном контроле проверяют пакет документов, то передавать все таки надо. Потому что если не передашь, то не узнаешь, есть ли необходимые документы. В будущем планируем сразу кладовщикам при приходе в «зону приема» показывать, какие именно проверить документы, сертификаты.
Следующий индикатор — Непосредственно сам входной контроль. Это то, что уже передано на ВК. Здесь тоже может быть довольно много позиций, особенно на старте, когда люди еще не привыкли к системе и не очень понимают, как необходимо работать. Не так много записей, как в очереди, но тоже прилично. В нормальной ситуации здесь не должно быть много записей.
Нормальная работа — это когда ты берешь себе на ВК позицию, когда ты готов ее проверять, а не просто потому что она в очереди черная. Этому люди учатся со временем.
По результатам проверки на ВК позиция передается либо на питающий производство склад (РЦ), либо в изолятор, либо в брак. Если товар требует прохождения ВК, то до тех пор пока он не пройден система не разрешит запустить производственное задание, которое в нем нуждается. В то же время система покажет, что это задание ждет именно вот этого болта, который сейчас лежит на входном контроле. Чуть ниже покажу, как это работает.
Кстати, номер перемещения на ВК — это и есть номер входного контроля, который можно наносить на изделия. В том числе и штрих-кодом.
Если позиция в порядке, то ее с входного контроля разрешают к приему на питающий склад. Несут туда, и кладовщик питающего склада принимает ее на склад в программе. Тут уже адресное хранение, все дела.
Если позиция физически в порядке, но не хватает важных документов, то ее кладут в изолятор. Она тут же попадает в очередь изолятора, за которой наблюдают закупщики. Все, что там есть — это предмет для беспокойства закупщиков. Это значит, что поставщик не привез нужные документы. В этом списке тоже может быть довольно много записей, поэтому и здесь мы показываем приоритет, чтобы закупщики понимали, какой позицией заниматься в первую очередь, какой во вторую и т.д.
Позиция, находящаяся в изоляторе, блокирует возможность запуска задания, но при этом система показывает, что проблема именно в этом болте, который лежит в изоляторе.
Если позиция бракованная, то ее переводят с входного контроля в брак, после чего система автоматически рождает новую потребность и эта же позиция опять появляется в графике закупок.
То есть разница между Изолятором и Браком состоит в том, что нахождение позиции в изоляторе не рождает новую потребность, а нахождение в браке — рождает.
Если все ок, то железка оказывается на питающем складе, откуда производству можно забирать комплектующие, о чем они и получат сигнал, что можно формировать производственное задание.
Производство запускает задания непосредственно из очереди. Каждый участок видит свою очередь.
Вот так выглядит единая очередь по всем участкам. Обратите внимание на первую запись. Написано «Можно» 0, но «Можно ВК» 52. Это значит, что что-то застряло на входном контроле.
Чтобы понять, что именно застряло, нажимаем специальную кнопочку и видим, что в «Зоне приема» застряло «Ребро УБГ-СГ 5131.01.02.01.104-03». Оно сейчас находится в очереди входного контроля.
Запустить это задание система не даст, пока не будет пройден входной контроль этого ребра.
В этом случае просто переходим к следующей позиции, которую производить можно и запускаем ПЗ.
Как только мы запустим ПЗ, система тут же создаст распоряжение на выдачу необходимых материалов с питающего склада. На материалы, которые есть на участке, никакого распоряжения, разумеется не будет. Печатаем бланк ПЗ и выдаем на участок вместе с маршрутным листом.
По факту исполнения ПЗ передаем его на ОТК и оно попадает в очередь ОТК. Инженеры ОТК работают с этой очередью. Если все ок, то позицию разрешают к приему на следующий участок. Если нет, то инженер ОТК возвращает ее обратно на участок и она уходит из очереди ОТК обратно в производство. При необходимости может написать, в чем конкретно проблема. Но обычно не пишут, потому что общаются )
Затем открывается ПЗ следующим участком, затем следующим и т.д. И так пока изделие не доберется до финиша.
Если производственный цикл короткий (изделие можно выполнить за смену), то тогда люди пользуются не узловой очередью, а очередью готовых изделий и стартуют изделие оттуда. Тогда система сразу создает все ПЗ для этого изделия на все участки.
Ну и, пожалуй, венец всей модели управления — это очередь платежей.
Круто управлять производством — это не только круто управлять всей логистикой, но и круто управлять деньгами. Иначе вся крутизна логистики разобьется о бессистемность платежей.
Ну и пожалуй, что все.
Затем все физические движения товара отправляются в 1с (где с ними что-то делают бухгалтеры) при помощи специального обработчика, который можно скачать здесь.
PS. Полное построение всех графиков работы (график производства, график закупок, график прохождения входного контроля, ОТК, изолятор и т.д.) занимает не более 30 минут!!! Это на самом сложном проекте, где некоторые изделия состоят из десяти тысяч элементов. На более простых проектах это занимает вообще несколько минут. Просто немыслимая цифра. Я как-то был в Челябинске на заводе, где уже лет пять пытаются внедрить BAAN. Верней уже даже и не пытаются. Так вот, там график производства считается часа четыре. Только производства. Графика закупок, как такового, нет, я уже не говорю про всякие очереди изоляторов, ОТК, входного контроля и т.д. Сколько бы это вместе считалось даже представить страшно. При этом никакой промышленной эксплуатации там нет, база пустая.
⟵ Новейшие разработки в области управления производством | Основы эффективного производства ⟶
Изображения в HTML — Изучение веб-разработки
В начале Web был просто текстом, что было довольно скучно. К счастью, это продолжалось не долго — до появления возможности вставлять изображения (и другие, более интересные, типы контента) в веб-страницы. Существуют и другие типы мультимедиа, однако логичнее начать со скромного <img>
элемента, используемого для вставки простого изображения в веб-страницу. В этой статье мы рассмотрим, как использовать элемент, начиная с основ, снабжать примечаниями, используя <figure>
, и разберём, как это относится к фоновым изображениям CSS.
Чтобы разместить изображение на странице, нужно использовать тег <img>
. Это пустой элемент (имеется ввиду, что не содержит текста и закрывающего тега), который требует минимум один атрибут для использования — src
(произносится эс-ар-си, иногда говорят его полное название, source). Атрибут src
содержит путь к изображению, которое вы хотите встроить в страницу, и может быть относительным или абсолютным URL, точно так же, как значения атрибута href
для элемента <a>
.
Примечание: Перед тем как продолжить, вам стоит вспомнить про типы адресов URL, чтобы обновить в памяти про относительные и абсолютные адреса.
Например, если ваше изображение называется dinosaur.jpg
, и оно находится в той же директории что и ваша HTML страница, вы можете встроить это изображение как:
Если изображение было в поддиректории images
, находящаяся внутри той же директории, что и HTML страница (что рекомендует Google для индексации и целей SEO), тогда вы можете встроить его так:
<img src="images/dinosaur.jpg">
И так далее.
Примечание: Поисковые системы также читают имена изображений и считают их для оптимизации поискового запроса. Поэтому присваивайте вашим изображениям смысловые имена: dinosaur.jpg
лучше, чем img835.png
.
Вы можете встроить изображение используя абсолютный URL, например:
<img src="https://www.example.com/images/dinosaur.jpg">
Но это бессмысленно, так как он просто заставляет браузер делать больше работы, запрашивая каждый раз IP-адрес от DNS-сервера. Вы почти всегда будете держать свои изображения для сайта на том же сервере, что и ваш HTML.
Внимание: Большинство изображений защищены. Не отображайте изображения на вашем сайте пока:
- вы не будете владеть изображением
- у вас не будет письменного разрешения владельца изображения, или
- пока у вас не будет достаточно доказательств что изображение находится в открытом доступе.
Нарушение авторских прав является незаконным. Кроме того, никогда не указывайте в своём атрибуте src
ссылку на изображение, размещённое на чужом сайте. Это называется «хотлинкинг» (с англ. ‘hotlinking’ — ‘горячая ссылка’). Запомните, кража пропускной способности чужого сайта незаконна. Это также замедляет вашу страницу и не позволяет вам контролировать, будет ли изображение удалено или заменено чем-то неприятным.
Наш код выше даст нам следующий результат:
Примечание: Такие элементы как <img>
и <video>
иногда называются замещаемыми элементами. Это потому что содержание элемента и размер, определяет внешний ресурс (как изображение или видео файл), а не содержание самого элемента. Вы можете узнать о них больше в Замещаемых элементах.
Альтернативный текст
Следующий атрибут, который мы рассмотрим — alt
. Его значением должно быть текстовое описание изображения для использования в ситуациях, когда изображение не может быть просмотрено / отображено или отрисовка занимает много времени из-за медленного интернет-соединения. Чтобы продемонстрировать использование атрибута alt
на практике, внесём изменения в код из предыдущего примера:
<img src="images/dinosaur.jpg" alt="Голова и туловище скелета динозавра; у него большая голова с длинными острыми зубами">
Самый простой способ увидеть атрибут alt
в действии — это сделать намеренную ошибку в имени файла. Например, если бы мы написали имя изображения как dinosooooor.jpg
, браузер не смог бы его отобразить, и на экране появился бы текст из атрибута alt
:
Итак, в каких случаях текст из атрибута alt
может быть нам полезен? Приведём несколько примеров:
- Пользователь с нарушением зрения использует устройство чтения с экрана, которое может читать вслух описание элементов веб-страницы. На самом деле, наличие текста в атрибуте
alt
для описания изображения может быть полезно для большинства пользователей. - В случае, если была допущена ошибка в имени файла или пути к нему (как было описано выше).
- Браузер не поддерживает формат данного изображения. Некоторые люди до сих пор используют текстовые браузеры, такие как Lynx, которые вместо изображений отображают текст из атрибута
alt
. - Если вы хотите добавить возможность найти ваше изображение с помощью поисковых систем. Например, поисковые системы могут искать совпадения поисковых запросов с текстом атрибута
alt
. - Если пользователи отключили отображение изображений на странице для уменьшения объёма передаваемых данных и для сокрытия элементов, отвлекающих внимание. Это обычная практика для пользователей мобильных телефонов, а также в странах с маленькой пропускной способностью интернет-каналов и с высокой стоимостью интернет-трафика.
Что именно вы должны писать в атрибут alt
? В первую очередь, это зависит от того, зачем изображение вообще находится на странице. Другими словами, что вы потеряете, если ваше изображение не появится:
- Декорация. Вы должны использовать Фоновые изображения CSS для декоративных изображений, но если вы должны использовать HTML, добавьте пустой alt = «». Если изображение служит просто украшением и не является частью содержимого, добавьте пустой
alt=""
. Например, программа чтения с экрана не тратит время на чтение содержимого, которое не является важным для пользователя. - Контент. Если ваше изображение содержит важную информацию, передайте ту же информацию через краткий
alt
. Или даже лучше, в главном тексте, который все увидят. Не используйтеalt
, если можете обойтись без него. Насколько неудобно было бы для пользователя, если бы параграфы были написаны дважды в главном контенте? Если изображение адекватно описано в основном тексте, можете просто использоватьalt=""
. - Ссылка. Если вы помещаете изображение в
<a>
, для того, чтобы сделать из него ссылку, вы всё ещё должны использовать чёткие формулировки описания ссылок. В таком случае, вы сможете использовать элемент<a>
или атрибутalt
. Старайтесь выбрать лучший вариант. - Текст. Не пишите текст в изображениях. Если вашему заголовку понадобится тень, то лучше используйте для этого CSS вместо добавления текста в изображение. Однако, если действительно этого не избежать, то вам следует дополнить текст в атрибуте
alt
.
По существу, главная идея здесь это предоставить нечто полезное, для случая когда изображения не видны. Это гарантирует что все пользователи не упустят ничего из содержимого страницы. Попробуйте отключить изображения в своём браузере и посмотрите как всё выглядит. Вы вскоре выясните насколько полезным является альтернативный текст, если изображения не видны.
Ширина и высота
Вы можете использовать атрибуты width
и height
, чтобы указать ширину и высоту вашего изображения. Ширину и высоту вашего изображение можете найти различными способами. Например, на Mac можно использовать Cmd + I чтобы получить информацию по изображению. Повторяя наш пример, мы можем сделать так:
<img src="images/dinosaur.jpg"
alt="The head and torso of a dinosaur skeleton;
it has a large head with long sharp teeth"
>
Это не приводит к большой разнице в отображении при нормальных обстоятельствах. Но если изображение не будет показано, например, когда пользователь только что перешёл на страницу, а оно ещё не успело загрузится, вы укажите браузеру оставить место для отрисовки изображения:
Это хорошая практика, в результате страница загрузится быстрее и более гладко.
Однако, вы не должны изменять размеры ваших изображений используя HTML атрибуты. Если вы установите размер изображения слишком большим, то в конечном итоге вы столкнётесь с изображениями, которые выглядят зернистыми, размытыми или слишком маленькими, и потратите трафик для загрузки изображения, которое не будет соответствовать нуждам пользователя. Конечное изображение может также выглядеть искажённым, если вы не сохраните правильное соотношение сторон. Рекомендуется использовать графический редактор для подгонки изображения к нужному размеру, перед вставкой его на вашу веб-страницу.
Примечание: Если вам действительно нужно изменить размер изображения, вы должны использовать вместо этого CSS.
Заголовок изображения
Как и для ссылок, вы также можете добавить атрибут title
для изображений, чтобы при необходимости предоставить дополнительную информацию. В нашем примере мы могли бы сделать это так:
<img src="images/dinosaur.jpg"
alt="The head and torso of a dinosaur skeleton;
it has a large head with long sharp teeth"
title="A T-Rex on display in the Manchester University Museum">
Это даёт нам всплывающую подсказку при наведении курсора мыши, также как и в ссылках:
Однако это не рекомендуется — title
имеет ряд проблем с доступностью, в основном из-за того, что поддержка программ чтения с экрана очень непредсказуема, и большинство браузеров не будут отображать её, если вы не наведёте курсор мыши (например, нет доступа для пользователей клавиатуры). Зачастую лучше включить такого рода вспомогательную информацию в основной текст статьи, чем прикреплять её к изображению. Однако, она полезна в некоторых обстоятельствах; например, в галереях изображений, когда у вас нет места для их заголовков.
Активное обучение: встраивание изображения
Наступила очередь немного поиграть! Этот раздел активного обучения поможет вам выполнить простое упражнение по встраиванию. Вы будете обеспечены простым <img>
тэгом; мы хотели бы чтобы вы встроили изображение расположенное по следующей ссылке:
https://raw.githubusercontent.com/mdn/learning-area/master/html/multimedia-and-embedding/images-in-html/dinosaur_small.jpg
Ранее мы говорили никогда не используйте горячие ссылки на изображения с других серверов, данный случай только для целей обучения, итак мы позволим вам пренебречь этим один разок.
Мы также хотели бы, чтобы вы:
- Добавили любой альтернативный текст, и проверили как это работает внеся ошибку в ссылку на изображение.
- Установите правильные значения
width
иheight
(подсказка: это 200px по ширине и 171px по высоте), после поэкспериментируйте с другими значениями, чтобы увидеть какой будет эффект. - Установите
title
для изображения.
Если вы сделаете ошибку, вы всегда можете очистить код, используя кнопку Reset. Если вы реально не будете понимать как сделать, нажмите кнопку Show solution, чтобы увидеть ответ:
Начиная разговор о заголовках, есть множество путей как вы можете добавить заголовок к своему изображению. Для примера, нет ничего, что может вас остановить сделать это таким образом:
<div>
<img src="images/dinosaur.jpg"
alt="The head and torso of a dinosaur skeleton;
it has a large head with long sharp teeth"
>
<p>A T-Rex on display in the Manchester University Museum.</p>
</div>
Это нормально. Это содержит всё что вам нужно, и красиво стилизуется с помощью CSS. Но, есть проблема: здесь нет ничего, что семантически связывает изображение с его заголовком, и это может вызвать сложности для читателей. Например, когда у вас есть 50 изображений и заголовков, какой заголовок идёт вместе с каким изображением?
Лучшим решением будет использование элементов HTML5 <figure>
и <figcaption>
. Они были созданы исключительно для этой цели: предоставить семантический контейнер для рисунков и чётко связать рисунок с заголовком. Наш пример выше мог бы быть переписан так:
<figure> <img src="images/dinosaur.jpg" alt="The head and torso of a dinosaur skeleton; it has a large head with long sharp teeth" > <figcaption>A T-Rex on display in the Manchester University Museum.</figcaption> </figure>
Элемент <figcaption>
говорит браузерам и вспомогательной технологии, что заголовок описывает содержимое элемента <figure>
.
Замечание: С точки зрения доступности, заголовки и alt
имеют различные предназначения. Заголовки помогают даже тем, кто имеет возможность просматривать изображение, тогда как alt
обеспечивает замену функциональности отсутствующего изображения. Таким образом, заголовки и alt
не подразумевают под собой одни и те же вещи, потому что оба используются браузером при отсутствии изображения. Попробуйте отключить изображения в своём браузере, чтобы увидеть как это выглядит.
Тег <figure> не является изображением. Он представляет собой независимый структурный элемент, который:
- Передаёт смысл компактным, интуитивно понятным способом.
- Может использоваться в различных местах страницы.
- Предоставляет ценную информацию, поддерживающую основной текст.
Тег <figure> может быть несколькими изображениями, куском кода, аудио, видео, уравнением, таблицей, либо чем-то другим.
Активное изучение: создание <figure>
В этом разделе активного изучения мы хотели бы, чтобы вы взяли текст из предыдущего раздела активного изучения и преобразовали его в <figure>:
- Оберните его в
<figure>
элемент. - Скопируйте текст из атрибута
title
, удалите атрибутtitle
, и вбейте текст в элемент<figcaption>
.
В случае допущения ошибки, вы всегда можете набрать код повторно, нажав кнопку Reset. Если вы застряли, нажмите кнопку Show solution, чтобы увидеть ответ:
Вы можете использовать CSS для встраивания изображений в веб-страницы (или JavaScript, но это совсем другая история). Параметры CSS background-image
и другие background-*
применяются для контроля размещения фонового изображения. К примеру, чтобы залить фон каждого параграфа страницы, необходимо сделать следующее:
p {
background-image: url("images/dinosaur.jpg");
}
Получившееся в конечном итоге изображение можно легко позиционировать и контролировать, в отличие от его HTML аналога. Так зачем же возиться с HTML изображениями? Как указано выше, фоновые изображения CSS предназначены только для украшения. Если вы просто хотите добавить что-то красивое на свою страницу, чтобы улучшить визуальные эффекты, это нормально. Тем не менее, такого рода изображения не имеют семантического смысла вообще. Они не могут иметь каких-то текстовых эквивалентов, видимых посетителю, они невидимы для программ чтения с экрана. Вот где блистают HTML-изображения!
Итог: если изображение имеет важность, в контексте содержимого вашей страницы, вам следует использовать HTML изображения. Если же картинка является банальной декорацией, используйте фоновые изображения CSS.
Вы дошли до конца этой статьи, но можете ли вы вспомнить самую важную информацию? Вы можете найти дополнительные тесты, чтобы убедиться, что вы усвоили эту информацию, прежде чем двигаться дальше. Смотрите Проверьте знания по изображениям в HTML.
На этом пока все. Мы подробно рассмотрели изображения и их заголовки. В следующей статье мы рассмотрим, как использовать HTML для встраивания видео и аудио на веб-страницы.
Аниме ава для вк парни
парные авы. Коллекция пользователя Meril Smith. Грустное Аниме Парни Из Аниме Мультфильм С Парой Милые Аниме Пары Рисунки Пар Аниме Рисунки Девушки Из Аниме Фотографии Для Обложки Руны Пары Аниме. Придя в свою комнату, он закрыл дверь и подошел к открытому окну, не включая свет
аватарки вконтакте аниме, анимированные. аватарки вконтакте аниме, гламурные. Аватар вконтакте Парень с аквариумом профиль, by Wolf-Fram. Очень бледный мажордом попытался преградить ему путь
Аватарки с аниме. По дате добавления Новые статусы Топ-30 этой категории Топ из всех категорий Популярные за 3 дня Популярные за месяц. #16. Девушка в шапке. #17. Грустная девушка. #18. Парень в необычном шлеме. #19. Зеленоглазая девушка. #20. Блондинка. – Я от Бориса; встреча через полчаса на станции фуникулера Сахарная Голова, приезжайте на вашей машине
Фото на аву. Лента Темы 111 Фото 708 Видео Участники 420. Фотопоток Фотоальбомы6. Фото Аниме для пацанов205. Класс15. загрузка. Не оставляя руля, он закурил сигарету и стал ждать
аватарки вконтакте аниме, грустные, парни, бабочки. аватарки вконтакте аниме, грустные, парни, глаза. – Бенто, вы стали объектом наблюдения со стороны человека, которого мы подозреваем в принадлежности к ЦРУ
Поиск по запросу «аниме парень». ani_tean. #кун #кун аниме #аниме кун #парень #парень аниме #аниме парень #кот #кошка. Стоя перед дверью и прислушиваясь, он машинально щупал свой пульс, следя глазами за секундной стрелкой часов
Ищешь группу или аву?? Тогда тебе к нам у нас тут всё качественное!!-1 набор аниме компании девушек для отметки- Напиши в коментариях если использавал их Будем рады за-1 набор зеленоглазых аниме парней- Напиши в коментариях если использовал их Будем рады. Морро да Таквара? Энрике хотел спросить ее, где это, но вовремя спохватился
Здесь админ и подписчики публикуют парные аниме обои, авы, а иногда не только парные (тройные и т. д. ) Под вторыми (последними) картинками пишу названия в виде хештегов, если точно его знаю. Итикира был таинственным человеком, в этом не было сомнений
Небольшой справочник о нашей группе. 1. Тут вы найдете хорошие, качественные арты с красивыми парнями из аниме или фильмов. 2. Послушаете музыку и найдете трек который возможно долго искали. 3. Познаете информацию о том или ином персонаже. Она обвинила его в том, что он шпион, предатель своей страны
Картинки на аву аниме для парней. 1526. Аниме-картинки, арты и рисунки на аватарку в ВК парням. Перед тем как сесть в машину, он долго рассматривал другие автомобили, стоящие на улице, но не заметил ничего подозрительного
Аниме парни. Коллекция пользователя AniKi • Последнее обновление: 12 недель назад. Uploaded by J. Find images and videos about boy, anime and manga on We Heart It — the app to get lost in what you love. Вчера вечером пришла телеграмма, что его отец попал в аварию
Дружить с парнем гораздо лучше, чем встречаться с ним!Просто арты и картинки на аву из самых разных аниме :). Аниме Авы для Парней и Девушек :З запись закреплена. Он увидел официанта, схватил его за рукав и сунул в руку купюру в десять крузейро
Аниме, скачать картинки и аватары. Аниме, прикольные фото и авы. Картинка 800 x 1067. Девушка. Парень и девушка Любовь Поцелуй. Она посмотрела на карту, висевшую на стене, и спросила, не переставая улыбаться:
музыка из аниме. 4:17. Аниме Фото на аву. Заходи не пожалеешь. Информация. Пожаловаться. Дайте эти аватарки, прошу. 1. Нравится Показать список оценивших. Почти пустая бутылка упала, покатилась и свалилась на пол, не разбившись
14. 09. 2020 — Просмотрите доску «Парные авы» в Pinterest пользователя 𝚢𝚘𝚞𝚛_𝗎𝗀𝗅𝗒_𝚘𝚙𝚙a⃤, на которую подписаны 494 человек. Image about couple in Anime picture by Zaco And Sebasjuro Amvs. Энрике был уже на пятом этаже, когда услышал сильный голос внизу:
Все тэги→ аниме → красивые → парни → → Прибавить тэг. аватарки вконтакте аниме, красивые, парни, ангелы. Он догнал ее, схватил за руку и заставил повернуться лицом к нему
Все тэги→ аниме → парни → рисунки → → Прибавить тэг. аватарки вконтакте аниме, парни, рисунки, глаза. Это был неплохие парни и девчонки, только очень уж они любили белый ром и от этого были несколько шумными
аниме, милые аватары вконтакте 920. Все тэги→ аниме → милые → → Прибавить тэг. аватарки вконтакте аниме, милые, ангелы. Вечером, вернувшись к себе, Энрике зачем-то полез в шкаф, и ему показалось, что его вещи обыскивали
У нас на сайте вы сможете найти и скачать лучшие картинки Аниме на аву в ВК для своего компьютера или телефона, отправляйте им друзьям и знакомым. Все подборки картинок находятся в отличном качестве, на сайте есть множество различных обоев на разные темы. – Да уж! Шутка великолепная! Слава богу, сеньор Моарес совершенно здоров! И зрение хорошее, и все остальное
Отличная и прикольная подборка аниме картинок для девушек и парней на аватарку, которые можно установить себе в ВК. Он хотел сказать ей многое, но не решался и злился на себя за эту робость
#тодороки шото #ава #ава аниме #ава аниме кун #ава для вк. #анима парень #ава аниме кун. Стоя на коленях с сосредоточенным видом, он чувствовал лишь огромное презрение ко всем этим идиотам, поклоняющимся неведомому богу
Чужой компьютер. Забыли пароль? ••• Топовые аниме авы •••. Будь няшкой — не забудь вступить ! Подписчики 341. Привет. ••• Топовые аниме авы ••• запись закреплена. 2 сен 2019. Действия. Отсюда он мог одновременно следить за обоими концами дороги
тут вы сможете найти себе крутые авы. Он поморщился, достал из кармана записную книжку и на странице, соответствующей данному дню, записал под полудюжиной таких же заметок: П
На фото парни аниме в очках. Очень похожи парни друг на друга, только пиджаки и причёски у них разные. Вполне подходит картинка аниме на аву как выражение раздвоенности и противоречивости личности. А таких сейчас людей много! На фото парни аниме в полный рост. Откровенно говоря, простой рассказ о его жизни составил бы не один авантюрный роман с лихо закрученными сюжетами
На нашем сайте вы всегда можете оценить красивые картинки на аву, открытки поздравления, аниме для парней ава и другие. Наш сайт ежедневно радует своих посетителей качественной информацией, а также интересными и прикольными картинками. Она ждала его за приоткрытой дверью, и ему осталось только войти
Apache Spark Parquet: невозможно создать пустую группу
Использую Apache Spark 2.1.1 (использовал 2.1.0 и он был таким же, сегодня переключился). У меня набор данных:
корень
| - мюоны: массив (nullable = true)
| | - элемент: структура (containsNull = true)
| | | - reco :: Candidate: struct (nullable = true)
| | | - qx3_: целое число (обнуляемое = истина)
| | | - pt_: float (nullable = true)
| | | - eta_: float (nullable = true)
| | | - phi_: float (nullable = true)
| | | - mass_: float (обнуляемый = true)
| | | - вершина_: структура (nullable = true)
| | | | - fCoordinates: struct (nullable = true)
| | | | | - fX: float (обнуляемый = true)
| | | | | - fY: float (nullable = true)
| | | | | - fZ: float (обнуляемый = true)
| | | - pdgId_: целое число (обнуляемое = true)
| | | - status_: целое число (nullable = true)
| | | - cachePolarFixed_: struct (nullable = true)
| | | - cacheCartesianFixed_: struct (nullable = true)
Как видите, в этой схеме 3 пустые структуры.Я на 100% знаю, что могу читать / манипулировать / делать что угодно. Однако при попытке записи на диск в паркет я получаю следующее исключение:
dsReduced.write.format ("паркет"). Save (outputPathName):
java.lang.IllegalStateException: невозможно создать пустую группу
в org.apache.parquet.Preconditions.checkState (Preconditions.java:91)
в org.apache.parquet.schema.Types $ BaseGroupBuilder.build (Types.java:622)
в org.apache.parquet.schema.Types $ BaseGroupBuilder.build (Types.java:497)
на org.apache.parquet.schema.Types $ Builder. named (Types.java:286)
в org.apache.spark.sql.execution.datasources.parquet.ParquetSchemaConverter.convertField (ParquetSchemaConverter.scala: 535)
в org.apache.spark.sql.execution.datasources.parquet.ParquetSchemaConverter.convertField (ParquetSchemaConverter.scala: 321)
в org.apache.spark.sql.execution.datasources.parquet.ParquetSchemaConverter $$ anonfun $ convertField $ 1.apply (ParquetSchemaConverter.scala: 534)
в org.apache.spark.sql.execution.datasources.parquet.ParquetSchemaConverter $$ anonfun $ convertField $ 1.применить (ParquetSchemaConverter.scala: 533)
Итак, в основном я хотел бы понять, ошибка это или предполагаемое поведение ??? Я также предполагаю, что это связано с пустыми структурами. Любая помощь могла бы быть полезна!
Обновление: я быстро создал урезанную версию, и она работает без проблем! Любое понимание было бы действительно полезно!
ВК
Брутальных аватарок для парней. Прикольные картинки на ava kid
Сложно подобрать картинки на аву в ВК, но мы постарались собрать для вас самые лучшие и топовые картинки для аватарок.Красивые фото и качественные картинки для мужчин, парней и парней.
Для обозначения вашего присутствия в интернете вам понадобится прикольный аватар. Но, учитывая необходимость защиты вашей конфиденциальности в Интернете, нет необходимости использовать вашу настоящую фотографию.
Будь то ВК, Steam, WhatsApp или любое другое приложение или социальная сеть, аватарок может быть несколько. Думаю, не нужно объяснять, что такое аватар (аватар, ава). Это изображение в вашем профиле, которое наиболее полно раскрывает вашу личность.характер, увлечения. Аватарок для мальчиков великое множество — от мультфильмов до баннеров, игр и героев фильмов.
Большие изображения уменьшены для удобства просмотра. Просто откройте их в новом окне или сохраните на свое устройство.
Крутые парни — крутые картинки с биткойном или кучей денег
Вы хипстер, хиппи или город с ума? Заинтересованы в игре на гитаре? Вот картинки для вашего av.
Представьте себя крутым парнем, который живет на грани, ну да ладно, берите крутые аватарки
Где взять крутые аватарки
Есть много сайтов, которые предлагают сделать аватарку самостоятельно.мы постарались выбрать лучшие картинки для мальчиков для аватарок во всех сетях и мессенджерах.
Любите пугать людей или считать себя причастным к темным или злым силам — аватарки для парней в свои профили.
Кто-то не из этого мира, а кто-то любит хорошие напитки. Прекрасные авы для вас, ребята!
Стиль жизни либо спортивный, либо адреналин. Какой у вас есть!
Если вы хотите остаться анонимным или спрятаться за маской штурмовика, у нас в коллекции есть такие мужские аватарки.
Какой костюм вам подходит — скелет или вы гонщик — выберите один.
Аватарки с пустыми глазами или со скелетной рукой
Прикольные фотки на аву для парней
Аватарка в капюшоне. Картинка скелет в стиле хип-хоп
Фотография бойца на аватарке для мужчин и мальчиков. Злое лицо для мужского аватара
Аниме Парень Аватар
Создать свой профиль в ВК не сложно. Для этого вам необходимо придумать пароль и ввести свой номер телефона.Сложности возникают, когда нужно определиться, какое фото поставить на аватарку. А также что писать о себе и нужно ли вообще эти данные заполнять на странице. В этой статье вы найдете прикольные ава фото для профиля в ВК для ребенка в ракурсе без лица. А также узнайте, где можно бесплатно взять изображения в Интернете.
Какой размер выбрать для Авы в ВК
Аватар ВКонтакте — это картинка, на которую в первую очередь обращают внимание все посетители вашей страницы.Чтобы в этом убедиться, вспомните себя, когда попадете в незнакомый профиль. А чтобы не случилось, что система при размещении обрезает важные части фотографии, используйте следующие пропорции: 1: 2,5. Это может быть изображение размером 400 × 1000 или 300 × 750 пикселей. Желательно не делать маленьких изображений.
Стандартные пропорции аватара — 1: 1, то есть квадратные изображения. Лучшим выбором будет 400 × 400 пикселей. Вы также можете использовать изображения размером 200 × 200 пикселей. Желательно, чтобы лицо или главный предмет на аве находились в центре.Стоит выбрать фотографию с одним объектом. Поскольку групповой снимок не позволит рассмотреть детали. Горизонтальные пропорции ВКонтакте не позволяют скачивать. Поэтому выбирайте вертикальные или квадратные снимки.
Прикольные фото на аватарку в ВК для мальчиков 14 лет
Не забываем про фон юзерпика в ВК. Ведь изображений без фона практически не бывает. Он также должен быть приятным и не отталкивающим. Особой разницы в возрасте для аватарок нет.Но могут быть разные интересы и вкусы посетителей разного возраста. Главное, чтобы вам нравилась Ава. А если это так, то понравится вашим друзьям и знакомым. Всем нравятся крутые фотографии мальчиков, на которых нельзя увидеть без лица. Но многие не задумываются о том, что они будут делать дальше, когда девушка предлагает погулять вместе.
Стильный парень в черной кепке
Крутой образ скелета в рубашке
Парень из тени — отличный выбор для Авы
Стиль и волшебство, которые вы дарите своим друзьям
Матрос Папай — тот еще сердцеед
Парень, которого обидел весь мир
Чисто Пацанский — Любимая мамочка
Если ты спортивный человек — Ава для тебя
Парень из пейнтбольного клуба
Ава отлично подчеркнет ваше отношение к другим
Поставьте эту аватарку, и ваш друг предложит вам переночевать дома
Классное фото с маской Джонса
Мы Придется выходить или отказываться от прогулки только из-за фейковой фотографии.Поэтому все же лучше использовать фото, где хорошо видно ваше лицо. Особенно, если этому ничего не мешает. Но если вы твердо решили использовать крутые изображения с других сайтов, можете взглянуть на нашу подборку. Их отбирали исходя из возраста молодых людей и их интересов. А также уже есть нужный размер для размещения.
Картинки для ВКонтакте для парней 18 лет
В 18 лет у большинства парней одна цель — произвести на девушек наилучшее впечатление. И добиться своего расположения.Это не только повышает вашу самооценку, но и вызывает уважение у друзей и знакомых. А если вы знаете, что нравится девушкам — проблем с выбором аватарки не возникнет. Весь женский пол интересуется хулиганами, а также спортивными и стильными мальчиками. Так что ава с балаклавой, оружием, с красивым накачанным мужским телом или шлепанец лыжника им точно понравится.
Лица не видны — ваш вариант
Покажи девушке, что она живет внутри тебя
Стильный парень из Watch Dogs
Ава для тех, кто много времени проводит за компьютерными играми
Мотоциклист — основной тип соблазнителя девушек
Аватар настоящего русского мужчины
Веселая рисованная аватарка
Лица не видно — как вы хотели
Красивое малиновое небо
Крутая ава без лица и цветного дыма
Важно не переборщить с наглостью.ВК, как и другие сервисы, зорко следит за действиями своих пользователей. А если администрация обнаружит на вашей странице запрещенный контент, ваш аккаунт может не только заблокировать. Но вас можно привлечь к ответственности. Никаких нарушений авторских прав — используйте изображения иностранных брендов и известных людей. Не используйте фотографии, на которых изображены сцены насилия в любой форме.
Где еще можно сфотографироваться на аву для мальчиков
Интернет позволяет делать снимки для профиля ВКонтакте абсолютно бесплатно и не нарушая никаких правил.Есть несколько довольно крупных ресурсов, которые распространяют эти бесплатные изображения.
А теперь рассмотрим лучшие из них, которые понимают русский язык и показывают много результатов:
Ссылка: | Характеристики: | |
---|---|---|
1 | https://ru.freeimages.com/ | Один из бесплатных и доступных фотобанков. Здесь изображения выкладывают пользователи со всего мира. Любое найденное вами изображение содержит информацию об использовании фильтров, размере, пропорциях и т. Д.Есть панель поиска, которая поможет вам найти нужную фотографию без лица. |
2 | https://freerangestock.com/ | Практически идентичный ресурс с небольшой разницей. Здесь вам нужно будет создать учетную запись, чтобы получить доступ к бесплатному архиву изображений. |
3 | https://pixabay.com/ru/ | Сайт с поддержкой русского языка. Он ориентирован на любителей природы и ценителей ее красоты. Но это не значит, что вы не можете найти здесь изображения на другие темы, например, крутое фото парня. |
4 | https://www.dreamstime.com/ | Фотобанк — это не только бесплатные фотографии. Этот сервис — излюбленное место фотографов и веб-дизайнеров. |
5 | https://www.flickr.com/ | Один из самых известных сервисов изображений в мире. |
6 | https://www.pinterest.ru/ | Для доступа к фото необходим аккаунт Google. |
Вы можете выбрать любой из этих сайтов с картинками и найти прикольную фотографию на свою аву в ВК для малыша, где не видно лица.Не имея даже больших знаний в одном из графических редакторов, вы можете сделать аватар самостоятельно.
эта иллюстрация отлично подойдет любителям киберпанка, а также фанатам компьютерных видеоигр. Честно говоря, понятия не имею, что символизирует эта картина, но мне она кажется вполне презентабельной. Если умеете рисовать в графическом редакторе — флаг вам в руки и вперед.
Прикольные картинки на ava kid должны быть тематическими. Например, именно такой картинкой можно разнообразить повседневную жизнь.Особенно, если вы впали в ярость в середине недели. И что? Иногда можно позволить себе расслабиться. Итак, вы всегда можете ответить на вопрос «Вы пьяны, но сегодня не пятница» — «Как это не пятница?»
Но этот гремлин для тех, кто неоднозначно воспринимает себя и обычно имеет очень сложные отношения с внешним миром. Я видел такой авататрук довольно часто и, честно говоря, мне это очень надоело. Но, может быть, кому-то она понравится, если он никогда ее раньше не видел.Ставьте смело. Поможет стать ближе к тем, кто вас боится 🙂
Аватар, в котором прослеживается просто железная логика. Ставить такую картину стоит либо новоиспеченной студии, либо тем, кто учится на первых трех курсах. Истинная секунда более вероятна. Новый ученик все еще усердно учится. Вот такие прикольные фотки на Ava kid.
VIP-лезвие для парней, которые любят ходить по бритвенному лезвию. VIP-бритва поможет намекнуть, что шутить с вами опасно — вы сделаете свое грязное дело и ничего VIP вам за это не дадут… Прикольные картинки на аву пацан — тема неиссякаемая.
Да, есть такое настроение, что хочется просто застрелиться, чтобы не думать, не видеть и не слышать многого из того, что происходит вокруг. Мальчикам также иногда необходимо сосредоточиться и замкнуться в себе. Это изображение профиля поможет. Наплевать на соц. сеть.
Никогда не поздно признаться матери в любви. Я знаю, что многие мальчики чтят своих мам (ты, кажется, своих мамочек называешь). Так что признать, что вы ее любите, — довольно смелый шаг.А девушки из таких парней просто катятся. Проверено.
Еще один красавчик для ВКонтакте. Он смотрит прямо в душу. Думаю, как бы я отреагировал на ребенка, который представит себе такую картинку — во-первых, он любит компьютерные игры, во-вторых, он хочет быть похожим на него, а в-третьих, он хочет произвести впечатление 🙂
Ну эта картина уже стала классической. Все фильмы из серии «Крик» выходят на экраны, каждый раз выводя историю на новый уровень. Вот на днях смотрел самую последнюю.Я вспомнил свою молодость, можно сказать. «Крутые картинки на ава малыш» рекомендую выложить эту картинку, когда всего хватит.
Мы не можем найти эту страницу
(* {{l10n_strings.REQUIRED_FIELD}})
{{l10n_strings.CREATE_NEW_COLLECTION}} *
{{l10n_strings.ADD_COLLECTION_DESCRIPTION}}
{{l10n_strings.COLLECTION_DESCRIPTION}} {{addToCollection.description.length}} / 500 {{l10n_strings.TAGS}} {{$ item}} {{l10n_strings.PRODUCTS}} {{l10n_strings.DRAG_TEXT}}{{l10n_strings.DRAG_TEXT_HELP}}
{{l10n_strings.LANGUAGE}} {{$ select.selected.display}}{{article.content_lang.display}}
{{l10n_strings.АВТОР}}{{l10n_strings.AUTHOR_TOOLTIP_TEXT}}
{{$ select.selected.display}} {{l10n_strings.CREATE_AND_ADD_TO_COLLECTION_MODAL_BUTTON}} {{l10n_strings.CREATE_A_COLLECTION_ERROR}}Зал славы водных видов спорта и городской совет достигают поселка
. Привет, путешественник во времени!
Эта статья была опубликована 26/3/2014 (2795 дней назад), поэтому информация в ней может быть устаревшей.
Ожесточенная вражда между мэрией и Залом славы водных видов спорта закончилась после вынесения в 2007 году решения по иску о выселении зала из бассейна Pan Am.
Люк Смолл, председатель правления Aquatics Hall, сказал, что он с нетерпением ждет сотрудничества с мэрией для демонстрации тысяч памятных вещей, которые хранились в коробках в течение восьми лет.
«Трудно не огорчаться, но я хочу работать как можно лучше с (мэрией), чтобы принести пользу нам обоим», — сказал Смолл.
Городской совет утвердил урегулирование судебного процесса, которое включает выплату наличными в размере 250 000 долларов США, позволяет холлу демонстрировать свою коллекцию на внутренних стенах бассейна Pan Am в новых витринах, предоставленных и установленных городом за 600 000 долларов США, и дает залу исключительное использование пространства галереи.
В Зале славы водных видов спорта и Музее Канады хранятся памятные вещи, связанные с четырьмя видами спорта в бассейне страны: скоростным плаванием, дайвингом, водным поло и синхронным плаванием.
Смолл сказал, что урегулирование является свидетельством самоотверженности покойного председателя совета директоров Воана Бэрда и других членов совета, которые умерли в ожидании разрешения спора.
«Воан всегда говорил, что город ждал его смерти, прежде чем они поселятся», — сказал Смолл.
Бэрд, бывший ныряльщик, международный судья по дайвингу и конституционный юрист, скончался в августе.
Зал славы и музей водных видов спорта был частью бассейна Pan Am с момента его постройки в 1967 году.На стенах беговой дорожки стояли памятные вещи — в том числе плавки Пьера Трюдо, картины олимпийского пловца Алекса Баумана, медали, которые когда-то принадлежали Виннипеггеру Рете Тастину, феномену плавания 1920-х и 1930-х годов, крупнейшей в мире коллекции олимпийских плакатов. и позже был представлен в галерее, пристройке, построенной в 1999 году.
Зал был выселен в 2006 году якобы из-за страховки, которую городские власти в то время настаивали на предоставлении зала, но которую Бэрд сказал, что ответственность за это несет город.
В 2007 году зал возбудил иск о возмещении ущерба в размере 21 миллиона долларов.
Отчет в совет на этой неделе показал, что Бэрд был прав с самого начала — холл передал свою коллекцию городу в 1973 году, который, в свою очередь, согласился сделать бассейн постоянным домом холла и застраховать коллекцию.
Бэрд утверждал, что спор был уловкой для города, чтобы приобрести пространство галереи и передать его рекреационным пользователям, что действительно произошло.
МэрСэм Кац сказал, что этим группам, в которые входят боулеры на лужайках, практикующие йогу и спортсмены-триаталоны, придется найти другие помещения для своих тренировок.
Смолл сказал, что зал не вернется в бассейн Pan Am до октября.1, добавление доски будет использовать промежуточное время для категоризации своей коллекции и планирования правильного отображения.
Small сказал, что зал будет связываться с группами пулов по всей стране, чтобы сообщить им, что они вернутся к работе, добавив, что он надеется, что зал сможет расширить свою коллекцию за счет более недавних приобретений.
Молекулярные основы выпрямления переходного тока в электрическом синапсе
Sci Adv. 2020 июл; 6 (27): eabb3076.
Отделение неврологии, Школа медицины Университета Коннектикута, Фармингтон, Коннектикут 06030, США.
* Текущий адрес: Кафедра патофизиологии, Школа базовой медицины и Медицинский колледж Тунцзи, Университет науки и технологий Хуачжун, Ухань, Китай.
† Текущий адрес: Комплексный онкологический центр Розуэлл-Парк, Отделение патологии, Элм и Карлтон-стрит, Буффало, Нью-Йорк 14263, США.
Поступило 14.02.2020 г .; Принято 20 мая 2020 г.
Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Нет претензий к оригинальным работам правительства США. Распространяется по некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC). Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе в течение длительного времени. поскольку в результате получается использование , а не для коммерческой выгоды и при условии правильного цитирования оригинальной работы.Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.Abstract
Выпрямляющие электрические синапсы (РЭС) существуют у всех видов животных, но их механизм выпрямления в значительной степени неизвестен. Мы исследовали, почему RES между премоторными интернейронами AVA и холинергическими мотонейронами A-типа (A-MNs) в контуре выхода Caenorhabditis elegans проводят переходные токи ( I j ) только в антидромном направлении. Эти RES состоят из иннексина UNC-7 в AVA и иннексина UNC-9 в A-MN.UNC-7 имеет несколько изоформ, различающихся длиной и последовательностью аминоконца. В системе гетерологической экспрессии только одна изоформа UNC-7, UNC-7b, может образовывать гетеротипические щелевые соединения (GJ) с UNC-9, которые сильно отдают предпочтение I j в направлении от UNC-9 к UNC-7. Нокаут unc-7b сам по себе почти устранял I j , тогда как AVA-специфическая экспрессия UNC-7b по существу устраняла дефект связывания у мутанта unc-7 .Нейтрализация заряженных остатков на аминоконце UNC-7b отменяет свойство ректификации GJs UNC-7b / UNC-9. Наши результаты предполагают, что свойство выпрямления является результатом электростатических взаимодействий между заряженными остатками на аминоконце UNC-7b.
ВВЕДЕНИЕ
Щелевые контакты (ЩК) — это межклеточные каналы, которые могут обеспечивать прохождение ионов и сигнальных молекул. GJs между нейронами обычно называют электрическими синапсами (ES), потому что они позволяют току течь между нейронами.Хотя большинство ES, о которых сообщалось на сегодняшний день, проводят токи в двух направлениях, накопление доказательств указывает на то, что многие ES выпрямляют ES, которые позволяют току течь преимущественно или исключительно в одном направлении. Выпрямляющие ES были впервые обнаружены у раков ( 1 ), а затем обнаружены у дополнительных видов костистых ( 2 , 3 ), мух ( 4 ), миног ( 5 ), пиявок ( 6 , ). 7 ), крабы ( 8 ), черви ( 9 ) и крысы ( 10 ).Выпрямляющие ES могут быть гораздо более распространенными, чем то, что было оценено, потому что их существование может быть обнаружено только с помощью электрофизиологической записи ( 10 , 11 ). Выпрямлению ESs приписывают множество физиологических функций, в том числе действие в качестве детекторов совпадений ( 12 , 13 ), содействие кооперативности афферентов с пресинаптическими нейронами ( 2 ) и усиление химической синаптической передачи в смешанных электрохимических условиях. синапсы ( 9 ).Поскольку выпрямление ES может комплексно влиять на функции нервной цепи, важно понимать молекулярные механизмы выпрямления.
GJs состоят из коннексинов у позвоночных и иннексинов у беспозвоночных. Каждый GJ представляет собой комплекс двух полуканалов, которые также известны как коннексоны или иннексоны в зависимости от молекулярного состава. В зависимости от того, имеют ли два полуканала идентичный молекулярный состав, GJs классифицируются на гомотипические и гетеротипические GJ.Молекулярные составы были предложены только для нескольких выпрямляющих ЭС, в том числе между гигантским волокном и мотонейронами или интернейронами у Drosophila ( 4 ), между слуховыми афферентами и клетками Маутнера у золотой рыбки ( 2 ) и между премоторными интернейроны и холинергические мотонейроны в контуре выхода Caenorhabditis elegans ( 9 ). Все эти выпрямляющие ES являются гетеротипическими GJ либо двух разных белков GJ ( 2 , 9 ), либо двумя разными изоформами одного белка GJ ( 4 ).Однако неизвестно, как переходные токи (, , , ) проводятся предпочтительно в одном направлении при выпрямлении ЭС. Одно недавнее исследование показало, что внутриклеточный каркасный белок локализуется и функционирует исключительно на постсинаптической стороне ES в системе клеток Маутнера у рыбок данио ( 14 ), но неизвестно, играет ли асимметричная локализация каркаса роль в ректификации. В другом исследовании ( 15 ) изучали эффекты обмена N-концов (перед первым трансмембранным доменом или TM1) между двумя разными изоформами иннексина Shaking B, Neural +16 Shaking B (ShakBN16) и Shaking B Lethal (ShakBL). , на функцию GJ с использованием системы гетерологической экспрессии ооцитов Xenopus .ShakBN16 и ShakBL являются предполагаемыми пре- и постсинаптическими белками GJ, соответственно, выпрямляющих ESs в системе волокон гигантских мух ( 4 ). Замена N-конца ShakBL на ShakBN16 заставляла химерный белок (SBL-NTN16) функционировать подобно ShakBN16 в гетеротипических GJs с ShakBL. Однако замена N-конца ShakBK16 на ShakBL не заставляла химерный белок функционировать подобно ShakBL в гетеротипных GJs с ShakBN16. Кроме того, гомотипные GJs SBL-NTN16 напоминали таковые ShakBL вместо ShakBN16 в зависимости от трансъункционального напряжения ( В, j ) и I j свойств дезактивации ( 15 ).Из этих результатов трудно сказать, играет ли N-конец роль в ректификации. Эта трудность усугубляется тем фактом, что различия в аминокислотных последовательностях между ShakBL и ShakBN16 не ограничиваются N-концом, а простираются до TM2.
GJs между парой премоторных интернейронов, известных как AVA, и холинергические мотонейроны A-типа (A-MN) в схеме выхода из C. elegans представляют уникальную возможность для раскрытия молекулярного механизма электрического выпрямления по ряду причин. .Во-первых, они проводят I j почти исключительно в одном направлении (от A-MN до AVA) ( 9 ). Во-вторых, их функциональные свойства могут быть проанализированы in vivo с использованием двухнейронных методов фиксации напряжения и тока ( 9 ). В-третьих, их молекулярный состав на пре- и постсинаптической стороне может быть генетически изменен клеточно-специфическим образом. Предыдущие исследования установили, что эти GJ состоят из иннексина UNC-7 в AVA и иннексина UNC-9 в A-MN ( 9 , 16 ).Однако UNC-7 имеет 10 различных изоформ от альтернативного сплайсинга. Неизвестно, какая изоформа UNC-7 важна для электрической связи и почему эта связь сильно выпрямляется. Здесь мы рассмотрели эти два вопроса посредством анализа биофизических свойств гомотипических и гетеротипных GJ, образованных UNC-9 и UNC-7 в ооцитах Xenopus , и анализа эффектов нокаута, нокаута, нокдауна и мутантного спасения изоформ-специфичных или нацеленных на клетки unc-7 о функции выпрямляющих ЭС in vivo.Наши результаты привели к идентификации конкретной изоформы UNC-7, UNC-7b, в качестве ключевого компонента выпрямляющих ES в цепи выхода червя, а также к предложению модели, в которой шарнирно-рецепторный механизм с участием UNC- 7b N-конец обеспечивает исправление. Это исследование показывает корреляцию ректификационных свойств между GJs in vivo и в гетерологичной системе экспрессии и представляет молекулярную модель механизма ректификации. Поскольку основные структурные и функциональные свойства GJs на основе иннексина и коннексина сохраняются ( 17 , 18 ), это исследование может дать представление о молекулярных механизмах ректификации GJ в целом.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Гомотипические ЩК, образованные UNC-7 и UNC-9, различаются по биофизическим свойствам
Чтобы понять молекулярный механизм ректификации I j между AVA и A-MN, мы начали с анализа биофизических свойств гомотипных GJs, образованные UNC-7 и UNC-9 в ооцитах Xenopus . В то время как UNC-9 имеет только одну функциональную изоформу (другая изоформа, указанная на веб-сайте Wormbase, вряд ли образует GJ, поскольку у нее отсутствует N-конец, TM1 и часть первой внеклеточной петли), UNC-7 имеет 10 изоформ (www.wormbase.org). Различные изоформы UNC-7 могут быть разделены на шесть групп в зависимости от их различий в N-конце: UNC-7a / j, UNC-7b, UNC-7c, UNC-7d / e, UNC-7f / g и UNC- 7ч / я (). Сгруппированные вместе изоформы различаются только двумя последовательными аминокислотными остатками, валином (V) и глутамином (Q) во внутриклеточной петле, которые присутствуют в изоформах a, b, c, d, f и h, но не в остальных изоформах. Длина N-конца перед TM1 сильно различается среди вариантов UNC-7, от 24 аминокислот в UNC-7c до 168 аминокислот в UNC-7d / e ().UNC-7c похож на UNC-9 в длине конца N ().
Изоформы UNC-7 различаются в основном длиной и аминокислотной последовательностью N-конца.( A ) Диаграмма, показывающая топологию мембраны UNC-7 и расположение вариабельных остатков валина и глутамина во внутриклеточной петле. ( B ) Диаграмма, показывающая различия концов UNC-7 N. Линии идентичного цвета представляют идентичные аминокислотные последовательности. аа, аминокислота. ( C ) Выравнивание N-концов различных изоформ UNC-7.( D ) Выравнивание концов N UNC-7c и UNC-9.
Мы проанализировали гомотипические GJs, образованные UNC-9 и шестью различными изоформами UNC-7 (a, b, c, e, f и h), представляющими шесть групп. В каждой паре ооцитов, экспрессирующих идентичный иннексин, к одному ооциту (ооцит №1) применяли серию ступеней мембранного напряжения ( В, м, ) от удерживающего напряжения -30 мВ, в то время как другой ооцит (ооцит № 2) удерживался постоянным при -30 мВ до записи I j (). V j определяется как « V m ооцита № 2 — V m ооцита № 1». Взаимосвязь между установившейся проводимостью перехода ( G j ) и V j была приспособлена к функции Больцмана (см. Материалы и методы) для количественной оценки V 0 ( V j , при котором G j — половина максимального значения), G jmin (минимум G j ) и A (константа кооперативности).Два разных антисмысловых олигонуклеотида коннексина 38 (Cx38) всегда совместно инъецировали с unc-7 и unc-9 комплементарными РНК (кРНК) для устранения потенциальных осложнений, вызванных эндогенными I j (подробности в материалах и методах). По крайней мере, одну пару контрольных ооцитов, которым инъецировали только два олигонуклеотида, анализировали электрофизиологически в каждый день записи. Эндогенные I j у них никогда не обнаруживались, о чем свидетельствует запись одного такого контрольного эксперимента (рис.S1).
Биофизические свойства гомотипических ЩК UNC-7 и UNC-9, экспрессированных в ооцитах Xenopus .( A ) Схема эксперимента с ооцитами. ( B ) Представитель I j следов. ( C ) Нормализованные G j — V j отношений. ( D ) Сравнение V 0 , G jmin и A . ( E ) Сравнение постоянных времени деактивации кривых I j при В j -110 и +110 мВ, которые были подогнаны к двухчленной экспоненциальной модели (красные пунктирные линии).В (D) и (E) значимые различия между левыми и правыми кривыми G j — V j обозначены знаками решетки (#) (парный тест t ), тогда как между разными ГС в виде звездочек (*) и треугольников (Δ) для левых и правых кривых G j -V j соответственно (двусторонний смешанный дисперсионный анализ ANOVA с апостериорным критерием Тьюки). P <0,05, P <0,01 и P <0.001 обозначаются одним, двумя и тремя символами соответственно. Число зарегистрированных пар ооцитов ( n ) составляло 16 UNC-7a, 10 UNC-7b, 12 UNC-7c, 9 UNC-7e, 10 UNC-7f, 11 UNC-7h и 9 UNC-9.
Все иннексины были способны образовывать гомотипические ЩК в ооцитах Xenopus . Эти GJs отображали двунаправленно симметричные I j () и колоколообразные G j — V j отношения () в ответ на положительные и отрицательные V j шагов.Однако они часто различались очевидной зависимостью V j (наклон кривой G j — V j ) () и V 0 , G jmin и Параметры (и таблица S1). Они также различались скоростью деактивации I j , что было определено количественно путем подгонки кривых I j при -110 и +110 мВ V j к двум экспонентам (и таблица S2).На основе очевидной зависимости V j и G jmin (), GJs можно грубо разделить на две группы. Группа 1 включает UNC-7c и UNC-9, а группа 2 включает остальные изоформы UNC-7. Группа 1 показала гораздо более слабую зависимость V j и гораздо большую G jmin , чем группа 2, как показывают количественные сравнения (). Поскольку N-конец короче в группе 1, чем в группе 2, эти наблюдения предполагают, что более длинный N-конец может давать более высокую степень зависимости V j и меньшую G jmin .Однако это не простая линейная зависимость между длиной N-конца и зависимостью V j . Например, UNC-7a был меньше V j -зависимым, чем UNC-7e и UNC-7h, но его N-конец имеет промежуточную длину. В совокупности наши наблюдения предполагают, что зависимость V j зависит как от длины, так и от аминокислотной последовательности N-конца.
Гетеротипический UNC-7b / UNC-9 GJ является сильным выпрямителем
Далее мы соединили ооциты, экспрессирующие UNC-9, с ооцитами, экспрессирующими различные изоформы UNC-7, и зарегистрировали I j из обоих ооцитов.Эти гетеротипные GJs UNC-7 / UNC-9 часто отображали двунаправленно асимметричные I j в ответ на положительные и отрицательные V j шагов, при этом I j следы от одного ооцита отражали следы от одного ооцита. другой из пары ().
Биофизические свойства гетеротипических ЩК UNC-7 и UNC-9, экспрессированных в ооцитах Xenopus .( A ) Представитель I j следов. ( B ) Нормализованные G j — V j отношения на основе I j , записанные из ооцита UNC-7.( C ) Сравнение V 0 , G jmin и A . Значительные различия между левыми и правыми кривыми G j — V j обозначены знаками решетки (#) (парный тест t ), тогда как между разными GJ — звездочками (*) и треугольниками ( Δ) для левой и правой кривых G j -V j кривых соответственно (двухфакторный смешанный дисперсионный анализ с апостериорным тестом Тьюки).( D ) Сравнение пиковых кривых I j — V j кривых между различными GJ. Пик I j был нормализован по той же записи на +110 или -110 мВ V j . ( E ) Сравнение соотношений пиков I j (-110 на 110 мВ) для I j , зарегистрированных из ооцита UNC-7. В (D) и (E) значимые отличия от некорректирующих UNC-7a / UNC-9 GJ отмечены звездочками (* P <0.01 и *** P <0,001) на основе двустороннего смешанного (D) или одностороннего (E) дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. Число зарегистрированных пар ооцитов ( n ) составило 12 UNC-7a / UNC-9, 13 UNC-7b / UNC-9, 14 UNC-7c / UNC-9, 9 UNC-7e / UNC-9, 15 UNC. -7f / UNC-9 и 12 UNC-7h / UNC-9.
Для простоты мы сосредотачиваемся на I j , записанном из ооцита UNC-7, и производном соотношении G j — V j . Гетеротипные ЩК могут быть разделены на две основные группы в зависимости от того, являются ли восходящие и нисходящие части кривой G j — V j грубо симметричными.Группа 1, включая UNC-7f / UNC-9 и UNC-7h / UNC-9 GJs, показала симметричные отношения G j — V j , тогда как группа 2, включая оставшиеся гетеротипные GJ, показала асимметричный G j — V j соотношение (). Группа 2 может быть дополнительно разделена на две подгруппы в соответствии с положением V j , соответствующего кажущемуся G jmax . Он был смещен влево (отрицательный диапазон В j ) с UNC-7b / UNC-9, но вправо (положительный диапазон В j диапазон) с UNC-7e / UNC-9, UNC-7c / UNC-9 и UNC-7a / UNC-9 ().Различия между соотношениями G j — V j различных GJ можно лучше оценить при количественном сравнении параметров V 0 , G jmin и A из подгонки Больцмана (и таблицы S3). Гетеротипические ЩК также различались по скорости активации и дезактивации, что было определено количественно путем сопоставления кривых I j при -110 и +110 мВ V j экспонентам (рис.S2A и таблица S4). Поскольку молекулярные различия между этими GJ ограничиваются вариациями N-конца UNC-7, эти результаты показывают, что N-конец UNC-7 играет важную роль в определении зависимости V j и других биофизических свойств гетеротипных GJ. . Примечательно, что UNC-7b / UNC-9 — единственный с очевидным G jmax при отрицательном V j . Учитывая, что V j = V m UNC-7 ооцитов — V m UNC-9 ооцитов, как мы определили, результаты показывают, что UNC-7b / UNC-9 GJ больше активен, чем любой из других гетеротипических GJ в отрицательном диапазоне V j (когда ооцит UNC-9 более деполяризован, чем ооцит UNC-7).
GJsUNC-7b / UNC-9 отличались от других гетеротипных GJ более заметно по пику I j , которые были измерены в идентичном временном окне как для положительного, так и для отрицательного V j шагов ( рис. S2B). В то время как другие допускали двунаправленный пик I j , гетеротипные GJ UNC-7b / UNC-9 проводили пик I j почти исключительно в направлении от ооцита UNC-9 к ооциту UNC-7 (), на что указывает обнаружение большого I j из ооцита UNC-7 при отрицательном V j , но из ооцита UNC-9 при положительном V j .Разницу в выпрямлении пика I j между UNC-7b / UNC-9 и другими гетеротипными GJ легче оценить, сравнив нормализованные I j — V j отношения () и соотношения отношение пика I j при −110 и +110 мВ (). Поскольку пик I j GJs UNC-7a / UNC-9 был симметричен между положительным и отрицательным диапазоном V j , использовалась их кривая I j — V j в качестве эталона для статистических сравнений, которые показывают, что пик I j ГДж UNC-7b / UNC-9 и UNC-7h / UNC-9 значительно исправлен, причем степень исправления в первом случае намного выше, чем в первом. последний ().Расчет пикового отношения I j (-110/110 мВ) для записей со стороны UNC-7 показывает, что это отношение было значительно выше в ГДж UNC-7b / UNC-9 и UNC-7h / UNC-9. чем в UNC-7a / UNC-9 ГДж (). В редких случаях пик I j гетеротипных GJ UNC-7h / UNC-9 и UNC-7f / UNC-9 также демонстрировал сильное выпрямление, на что указывает диаграмма рассеяния в образце I j следы на рис. S3. UNC-7f и UNC-7h больше похожи на UNC-7b по длине N-конца, чем другие изоформы UNC-7 ().Поскольку UNC-7b / UNC-9 GJs показали сильное выпрямление как в установившемся состоянии, так и в пике I j и способствовали потоку I j в том же направлении, что и in vivo (из A-MN, выражающих UNC- 9 до AVA, выражающей UNC-7) ( 9 ), наши результаты предполагают, что UNC-7b, вероятно, является ключевым компонентом GJ UNC-7 / UNC-9 между AVA и A-MN.
UNC-7b важен для связывания AVA / A-MN
Чтобы подтвердить предполагаемую роль UNC-7b в связывании AVA / A-MN, мы сначала экспрессировали репортер зеленого флуоресцентного белка (GFP) под контролем unc- 7b промотор (P unc-7b ), чтобы сделать вывод о характере экспрессии UNC-7b.В этом эксперименте использовали подход гомологичной рекомбинации, чтобы включить всю потенциальную последовательность P unc-7b . В частности, мы сконструировали плазмиду, которая включала короткий фрагмент последовательности ДНК перед сайтом инициации unc-7b и часть первого экзона unc-7b , слитого в рамке считывания с GFP. Этой плазмиде совместно инъецировали фосмиду, содержащую последовательность геномной ДНК размером 32,7 т.п.н. перед сайтом инициации unc-7b в существующий штамм с AVA, меченным mStrawberry ( 9 ).Гомологичная рекомбинация между плазмидой и фосмидой in vivo будет приводить к транскрипционному слиянию Punc-7b :: GFP (слева). У трансгенных червей экспрессия GFP наблюдалась во многих нейронах головы, включая два интернейрона AVA (справа), что позволяет предположить, что UNC-7b экспрессируется в AVA.
UNC-7b выражается в AVA и важен для связывания AVA / A-MN.( A ) unc-7b выражение в AVA. Слева: диаграмма, показывающая использование подхода гомологичной рекомбинации in vivo для создания транскрипционного слияния P unc-7b :: GFP.Плазмида, содержащая 525 п.н. проксимального промотора unc-7b (P unc-7b ) и часть первого экзона unc-7b , слитого в рамке считывания с GFP, была коинъектирована с фосмидой WRM0613cD09, которая содержит весь ген unc-7 в существующий штамм с AVA, меченным mStrawberry. Справа: экспрессия GFP наблюдалась в двух интернейронах AVA, меченных mStrawberry. ( B ) Схема и изображение, показывающие идентификацию VA5 и AVA на основе анатомического местоположения и маркировки GFP, соответственно, в электрофизиологических записях.( C ) Выбивка unc-7b устранила большую часть I j между AVA и VA5. ( D ) AVA-специфическая экспрессия UNC-7b дикого типа, но не UNC-7a, в значительной степени устраняла дефект связывания нуль-мутанта unc-7 (e5) . Данные в (C) и (D) были статистически проанализированы вместе (двухфакторный смешанный ANOVA). Показаны статистически значимые различия по сравнению с диким типом (C) или unc-7 (e5) (D) (* P <0,05, *** P <0.001). Количество проанализированных червей ( n ) было 7 дикого типа, 6 unc-7b нокаут, 7 unc-7 (e5) , 7 unc-7 (e5) с спасением UNC-7b, специфичным для AVA. и 11 unc-7 (e5) со спасением UNC-7a, специфичным для AVA.
Затем мы проанализировали влияние нокаута unc-7b на связь AVA / A-MN у частично иммобилизованных червей. unc-7b был нокаутирован у червей дикого типа путем мутации кодона лизина 14 (K14) до преждевременной остановки с использованием подхода CRISPR-Cas9.Эксперименты по фиксации напряжения с двумя нейронами были выполнены для записи I j между AVA и VA5, который был выбран в качестве представителя A-MN, потому что его легче идентифицировать на основе анатомии, чем другие A-MN (, слева) . Идентификация AVA была основана на экспрессии GFP, специфичной для AVA (справа). У червей дикого типа I j , зарегистрированные из AVA, были преимущественно во внутреннем направлении, тогда как червя из VA5 были преимущественно в наружном направлении в ответ на V j шагов от -80 до +80 мВ ( ). I j между AVA и VA5 не обнаруживались в unc-7 (e5) () и уменьшались более чем на 70% в нокаутном штамме unc-7b по сравнению с штаммом дикого типа (). Различные эффекты мутации unc-7 (e5) и нокаута unc-7b на электрическую связь обусловлены различиями в молекулярном повреждении unc-7 . В то время как UNC-7b был выборочно элиминирован в нокаутном штамме unc-7b , все изоформы UNC-7 отсутствуют в мутанте unc-7 (e5) , что является предполагаемым нулевым результатом в результате преждевременного стоп-кодона в предсказал первую внеклеточную петлю UNC-7 ( 19 ).Дефицит I j между AVA и VA5 в мутанте unc-7 (e5) был существенно устранен, когда UNC-7b дикого типа экспрессировался специфически в AVA с использованием подхода Cre-LoxP (). Чтобы определить, зависит ли спасительный эффект от конкретной изоформы UNC-7, мы протестировали эффект направленной на AVA экспрессии UNC-7a в AVA unc-7 (e5) , используя тот же подход. UNC-7a был выбран, потому что более раннее исследование показало, что его предполагаемая экспрессия в небольшом количестве нейронов, включая AVA, может спасти дефект локомоции у мутанта unc-7 ( 16 ).Неожиданно, хотя UNC-7a мог образовывать функциональные гетеротипические GJ с UNC-9 в системе экспрессии ооцитов Xenopus , это не вызывало какого-либо заметного улучшения связывания AVA / A-MN у мутанта unc-7 (e5) . (). Поэтому мы спросили, можно ли правильно выразить UNC-7a в AVA, пометив его тегом GFP. Мы обнаружили, что, хотя UNC-7a :: GFP напоминал UNC-7a в формировании как гомотипических, так и гетеротипических GJ (с UNC-9) в системе экспрессии ооцитов Xenopus (рис.S4A), сигнал GFP не мог быть обнаружен в AVA после того, как слитый белок был экспрессирован с использованием подхода Cre-LoxP (рис. S4B). Неспособность обнаружить экспрессию UNC-7a :: GFP в AVA, вероятно, объясняет неспособность UNC-7a устранить дефект связывания AVA / A-MN у мутанта unc-7 (e5) . Вместе наши результаты показывают, что UNC-7b в AVA важен для соединения AVA / A-MN.
Ректификация зависит от заряженных остатков на N-конце UNC-7b
Почему UNC-7b уникален тем, что может образовывать сильно выпрямляющие GJs с UNC-9? Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали потенциальную роль некоторых заряженных аминокислотных остатков на N-конце UNC-7b.Наше внимание привлекли два триплета противоположно заряженных аминокислотных остатков (HKK и DDD) на N-конце UNC-7 (). Хотя эти два триплета заряженных остатков не уникальны для UNC-7b (), электростатические взаимодействия между ними могут стабилизировать конформацию, которая позволяет уникальному N-концу UNC-7b (шар) связываться с рецепторным сайтом, чтобы блокировать поры GJ. (). Чтобы проверить эту гипотезу, мы нейтрализовали два триплета заряженных остатков в UNC-7b (H 45 K 46 K 47 и D 70 D 71 D 72 ) независимо замещением аланина и исследовали влияние мутаций на биофизические свойства ЩК UNC-7b / UNC-9 с использованием системы экспрессии ооцитов Xenopus .Свойство исправления было отменено мутацией DDD до AAA и сильно скомпрометировано мутацией HKK до AAA (). Мы подозревали, что неполное ингибирующее действие мутации HKK на AAA могло быть связано с другими молекулярными структурными различиями между исходными остатками и остатками аланина. Среди незаряженных аминокислотных остатков фенилаланин (F) и глутамин (Q) наиболее близки по структуре к H и K соответственно. Мы обнаружили, что замена остатков HKK в UNC-7b на FQQ по существу отменяет свойство ректификации GJs UNC-7b / UNC-9 ().
Ректификация гетеротипических GJ UNC-7b / UNC-9 зависит от заряженных остатков на N-конце UNC-7b.( A ) Аминокислотная последовательность N-конца UNC-7b. ( B ) Модель литника UNC-7b / UNC-9 GJ. N-конец UNC-7b (мяч) может связываться с предполагаемым рецепторным сайтом V j -зависимым образом, чтобы блокировать GJ. Красные линии представляют собой электростатические взаимодействия между двумя тройками противоположно заряженных остатков [остатки «HKK» и «DDD» в (A)], тогда как знак плюс (+) представляет остатки K 13 K 14 в UNC- 7b.( C ) Представитель I j следов, показывающих эффекты нейтрализации заряженных остатков в UNC-7b. ( D ) Нормализованное I j — V j отношения пика I j . Звездочка (*) указывает P <0,001 по сравнению с диким типом (те же данные в двухстороннем смешанном ANOVA). Зарегистрированные пары ооцитов (из ооцитов UNC-7b / UNC-9) были 10/9 DDD AAA, 13/11 HKK AAA, 11/10 HKK FQQ и 11/9 KK AA.( E ) Репрезентативные кривые I j , показывающие эффекты замены местами двух триплетов противоположно заряженных аминокислотных остатков. ( F ) Пик I j — V j отношений. Пик I j был нормализован по пику каждой записи на +110 или -110 мВ. Регистрируемые пары ооцитов составляли от 5 до 10 на группу.
Затем мы проверили, может ли UNC-7b по-прежнему придавать свойство ректификации гетеротипным GJ с UNC-9 после переключения положений двух триплетов заряженных остатков (HKK и DDD).Мы обнаружили, что мутировавший UNC-7b (DDD / KKH) не сохранил способность давать ректификацию (). Мы задавались вопросом, может ли комбинация переключения местоположений DDD и HKK и замены их другими аналогично заряженными остатками позволить UNC-7b восстановить свою способность к исправлению путем тестирования эффектов мутаций EEE / KKK и DDD / KKK. Однако эти две мутировавшие изоформы UNC-7b также не позволяли UNC-7b восстанавливать свою способность обеспечивать ректификацию (). Эти результаты предполагают, что расположение двух триплетов заряженных остатков также важно для правильного функционирования UNC-7b.
Наконец, мы исследовали эффект нейтрализации двух остатков лизина (K 13 K 14 ) на уникальном N-конце UNC-7b. Мы обнаружили, что мутация привела к уменьшению пика I j , зарегистрированного из ооцита UNC-9, но не из ооцита UNC-7b в гетеротипических GJs UNC-7b / UNC-9 (). Поскольку пик I j , зарегистрированный для ооцитов UNC-7b и UNC-9, имел идентичную движущую силу, но был результатом деполяризации ооцита UNC-9 и гиперполяризации ооцита UNC-7b соответственно, результаты предполагают, что присутствие эти два остатка лизина могут модулировать GJ gating зависимым от напряжения мембраны образом.Предположительно, два остатка лизина могут увеличивать проводимость гетеротипического GJ из-за электростатической силы от отрицательного электрического поля гиперполяризации ооцитов UNC-7b ().
ОБСУЖДЕНИЕ
Это исследование показывает, что UNC-7b является ключевым компонентом выпрямляющих GJs между AVA и A-MNs в C. elegans ускользает от нейронной цепи и что его N-конец играет критическую роль в выпрямлении. Эти выводы подтверждаются множеством доказательств, включая сильно выпрямленные пиковые и стационарные I j GJs UNC-7b / UNC-9 в системе экспрессии ооцитов Xenopus , соответствие I j направление ректификации между системой экспрессии ооцита и связыванием AVA / A-MN, устранение дефекта связывания мутанта unc-7 с помощью AVA-специфической экспрессии UNC-7b, дефицит связывания AVA / A-MNs при нокауте unc-7b деформации и потери свойства ректификации после нейтрализации одного из двух кластеров противоположно заряженных остатков на N-конце UNC-7b.Учитывая, что ЩК наблюдаются во всей нервной системе C. elegans ( 20 ) и что как UNC-7, так и UNC-9 экспрессируются во многих нейронах ( 21 , 22 ), можно предположить, что UNC-7b может также придавать ректификационные свойства GJs в другом месте, чтобы влиять на динамику и поведение цепи.
Наши анализы мутирующих заряженных аминокислотных остатков на N-конце UNC-7b отдают предпочтение модели, в которой свойство ректификации GJ UNC-7b / UNC-9 зависит от шарнирно-рецепторного механизма ().Однако эта модель, по-видимому, противоречит тому факту, что гомотипные GJ UNC-7b были проводящими и что присутствующие HKK и DDD не являются уникальными для UNC-7b. Эти два очевидных конфликта могут быть урегулированы путем введения элементов UNC-9-индуцибельного рецепторного сайта в UNC-7b иннексон и ограничения размера шарика N-конца, чтобы соответствовать предполагаемому рецепторному сайту. В этой модели стыковка иннексона UNC-9 с иннексоном UNC-7b индуцирует предполагаемый рецепторный сайт для N-конца UNC-7b. Гомотипические ЩК UNC-7b являются проводящими из-за отсутствия рецепторного сайта.N-конец UNC-7c не может закупорить GJ, потому что в нем отсутствуют остатки HKK. Хотя другие изоформы UNC-7 также имеют два триплета заряженных остатков, их N-концевые шарики слишком велики, чтобы поместиться в рецепторном сайте. Наша модель также объясняет, почему UNC-7f и UNC-7h, которые имеют немного большую длину N-конца, чем UNC-7b, могут иногда вызывать сильное выпрямление I j , и почему два положительно заряженных остатка (K 13 и K 14 ) в UNC-7b может способствовать V j -зависимому стробированию.Хотя мы не можем исключить другие возможности, эта модель кажется наиболее правдоподобной для объяснения того, как UNC-7 и UNC-9 могут формировать сильно выпрямляющие гетеротипические GJs между AVA и A-MN.
Шариковая и рецепторная модель UNC-7 / UNC-9 гетеротипного гейтирования GJ.( A ) Гомотипические ЩК UNC-7b являются проводящими из-за отсутствия рецепторной стороны для N-концевого шарика. ( B ) Рецепторный сайт для шарика (представленный выемкой, обращенной к поре канала) индуцируется в полуканале UNC-7 посредством стыковки полуканала UNC-9.Взаимодействие между мячом и рецептором зависит от предполагаемых солевых мостиков между HKK и DDD (показано горизонтальными красными линиями) и полярности V j . Шарик связывается с рецепторным участком, блокируя поры канала, когда клетка UNC-7b более деполяризована, чем клетка UNC-9, но отделяется от рецепторного участка, когда клетка UNC-9 более деполяризована, чем клетка UNC-7b. Заряженные остатки K 13 и K 14 в уникальной N-концевой последовательности UNC-7b (представленной красными крестиками) влияют на GJ-стробирование в зависимости от напряжения мембраны.В частности, более гиперполяризованный мембранный потенциал клетки UNC-7b увеличивает проводимость GJ из-за более сильного притягивающего эффекта на N-концевой шар от отрицательного электрического поля, создаваемого гиперполяризацией клетки UNC-7b. ( C ) Концы N других изоформ UNC-7 (кроме UNC-7c) слишком велики, чтобы поместиться в рецепторном сайте. ( D ) UNC-7c не способствует ректификации, поскольку в нем отсутствуют остатки, необходимые для образования солевых мостиков HKK-DDD. Сплошные синие и черные сферы представляют собой N-конец UNC-7c и UNC-9 соответственно.Символы «плюс» и «минус» указывают, является ли мембранный потенциал одной клетки более деполяризованным или гиперполяризованным по сравнению с мембранным потенциалом контактирующей клетки.
Мутанты unc-7 и unc-9 демонстрируют нерегулярные изгибы тела и значительно сниженную двигательную активность вперед по сравнению с диким типом ( 16 , 23 ). Предыдущие исследования определили, что две пары премоторных интернейронов, AVB и AVA, играют центральную роль в локомоции. В то время как AVA важна для обратной локомоции и связывается с холинергическими A-MN как через химические синапсы, так и через ES, AVB важна для продвижения вперед и связывается с холинергическими MN типа B (B-MN) только через ES ( 24 ).Более раннее исследование идентифицировало первые три изоформы UNC-7, включая UNC-7a (UNC-7 L), UNC-7b (UNC-7S) и UNC-7c (UNC-7SR), и предположило, что GJ между AVB и B-MN состоят из UNC-7b в AVB и UNC-9 в B-MN ( 19 ). Однако биофизические свойства GJs между AVB и B-MN и предполагаемая роль UNC-7b в сцеплении не были исследованы электрофизиологическими анализами. Последующее исследование показало, что экспрессия UNC-7a дикого типа под контролем промотора nmr-1 или rig-3 может устранить дефект локомоции у мутанта unc-7 ( 16 ).Поскольку оба промотора активны в AVA, но не в AVB, результаты показывают, что UNC-7a может функционировать в AVA, чтобы установить связь AVA / A-MN. Однако мы обнаружили, что UNC-7a не оказывал спасающего действия на связывание AVA / A-MN у мутантных червей unc-7 , возможно, из-за нарушения экспрессии UNC-7a в AVA. В соответствии с нашими наблюдениями, более раннее исследование не выявило ни спасительного эффекта UNC-7a дикого типа на поведение мутанта unc-7 , ни экспрессии слитого белка UNC-7a :: GFP у трансгенных червей ( 19 ).Мы предполагаем, что спасительный эффект UNC-7a на дефекты локомоции у мутанта unc-7 в предыдущем исследовании ( 16 ) может быть связан с функцией UNC-7a в других нейронах, поскольку nmr-1 и rig-3 промоторы , используемые для экспрессии, нацеленной на AVA, также проявляют активность в некоторых других нейронах (www.wormbase.org).
В результате этого исследования возникли два очевидных вопроса. Почему небольшое количество I j сохранялось в нокаутном штамме unc-7b ? Почему не удалось полностью устранить дефект связывания AVA / A-MN у мутанта unc-7 путем экспрессии UNC-7b конкретно в AVA? Одна возможность состоит в том, что иннексон UNC-7 в AVA представляет собой гетеромерный комплекс, состоящий из UNC-7b и другой изоформы UNC-7, и присутствие любого из них по отдельности недостаточно для образования полностью функциональных GJ с UNC-9.Идентификация другой предполагаемой изоформы UNC-7, функционирующей в AVA, потенциально представляет собой серьезную проблему, учитывая большое количество изоформ UNC-7 и множество возможных экспериментов, необходимых для правильного рассмотрения каждой возможности. Тем не менее, нет никаких сомнений в том, что UNC-7b является ключевым компонентом GJ между AVA и A-MN.
I j Кинетика гетеротипических ГК UNC-7b / UNC-9 сильно отличалась от кинетики ГК UNC-7 / UNC-9 in vivo. Различия в регуляторных белках и посттрансляционные модификации между этими двумя системами могут потенциально изменять функциональные свойства GJ.Например, GJ UNC-9 требует, чтобы UNC-1, стоматоподобный белок, функционировал в C. elegans ( 25 , 26 ), но не в ооцитах Xenopus . Очевидная несостоятельность UNC-1 для GJ UNC-9 в ооцитах Xenopus может быть связана с заменой UNC-1 эндогенным стоматиноподобным белком, поскольку геном Xenopus laevis содержит несколько стоматиноподобных генов ( 27 ). Стоит отметить, что система экспрессии ооцитов Xenopus использовалась для анализа биофизических свойств гомотипических и гетеротипических GJ, образованных UNC-9 и двумя разными изоформами UNC-7 (a и b) ( 19 ).Однако более раннее исследование не обнаружило каких-либо значительных различий в биофизических свойствах между гомотипными GJ UNC-7a и UNC-7b и между гетеротипными GJ UNC-7a / UNC-9 и UNC-7b / UNC-9. Был сделан вывод, что N-конец UNC-7 мало влияет на стробирование напряжения GJ. Неясно, почему предыдущее исследование не смогло выявить эффекты N-конца UNC-7 на функцию GJ.
Хотя коннексины и иннексины принадлежат к двум разным семействам белков, образованные ими GJ имеют общие структурные и функциональные свойства.Например, N-концы коннексинов и иннексинов расположены в пространстве путей проникновения GJ ( 28 — 31 ). Исследования коннексинов привели к заключению, что N-конец контролирует зависимость V j ( 15 , 32 — 35 ), и эта функция зависит от заряженных аминокислотных остатков ( 32 — 34 , 36 ). Роли N-конца UNC-7b в GJ gating, описанные здесь, согласуются с этими структурными и функциональными данными GJs.Т.о., N-концы могут играть эволюционно консервативную роль в придании ректификационных свойств нейрональным GJs, чтобы влиять на динамику нервных цепей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культура и штаммы C. elegansГермафродиты C. elegans выращивали на чашках со стандартной питательной средой для нематод со слоем OP50 Escherichia coli при 22 ° C внутри камеры для окружающей среды. В этом исследовании были использованы следующие штаммы (плазмиды для создания трансгенных штаммов обозначены числами с префиксом « wp »): ZW704: zwEx175 [Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP: : mCherry :: SL2 :: GFP (wp1383), Pgpa-14 :: Cre (pNP259)] .ZW731: zwEx175 [Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: mCherry :: SL2 :: GFP (wp1383), Pgpa-14 :: Cre (pNP259)]; unc-7 (e5). ZW1121: zwEx175 [Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: mCherry :: SL2 :: GFP (wp1383), Pgpa-14 :: Cre (pNP259)]; УНЦ-7 (ZW98) . ZW1251: zwEx175 [Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: mCherry :: SL2 :: GFP (wp1383), Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: unc-7a (wp1677), Pgpa-14 :: Cre (pNP259)]; унс-7 (е5) . ZW1252: zwEx175 [Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: mCherry :: SL2 :: GFP (wp1383), Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: unc-7b (wp1678), Pgpa-14 :: Cre (pNP259)]; унс-7 (е5) .ZW1414: zwIs143 [Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: mStrawberry (wp1392), Pgpa-14 :: Cre (pNP259), lin-15 (+)]; zwEx261 [Punc-7b :: GFP (wp1691 + p1692)]. ZW1531: zwEx276 [Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: UNC-7a :: EGFP (wp1961), Pflp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: mStrawberry (wp1339), Pgpa-14 :: Cre (pNP259)]; унс-7 (е5) .
клонирование кДНК
unc-7a комплементарную ДНК (кДНК) клонировали с помощью вложенной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) с использованием библиотеки кДНК первой цепи червей дикого типа в качестве матрицы.Смысловые / антисмысловые праймеры, использованные для первой и второй ПЦР, составляли 169/170 и 171/664 соответственно. Второй продукт ПЦР клонировали в вектор экспрессии ооцитов pXMX-T3 (-) по сайтам Bamh2 / EcoR1 с получением плазмиды unc-7a ( wp776 ). КДНК unc-7b получали с помощью ПЦР с использованием плазмиды wp776 в качестве матрицы и пары 2036/3036 смысловой / антисмысловой праймер. Праймер 2036 содержал 5′-концевую последовательность, уникальную для кДНК unc-7b , в то время как праймер 3036 комплементарен общему 3′-концу кДНК unc-7 .Продукт ПЦР клонировали в pXMX-T3 (-) в сайтах Xho1 / Age1 с получением плазмиды unc-7b ( wp1275 ). unc-7c кДНК клонировали с помощью ПЦР с использованием wp776 в качестве матрицы и пары 1854/3036 смысловой / антисмысловой праймер. Продукт ПЦР клонировали в pXMX-T3 (-) в сайтах Bamh2 / Age1 с получением экспрессионной плазмиды unc-7c ( wp1239 ). unc-7e кДНК клонировали вложенной ОТ-ПЦР с использованием библиотеки кДНК первой цепи червей дикого типа в качестве матрицы.Смысловые / антисмысловые праймеры, используемые для первой и второй ПЦР, были 3491/3492 и 3539/3540 соответственно. Второй продукт ПЦР клонировали в pXMXT-3 (-) в сайтах Pst1 / Age1 с получением экспрессионной плазмиды unc-7e ( wp1742 ). КДНК unc-7f клонировали с помощью ПЦР с использованием плазмиды wp776 в качестве матрицы и пары смысловой / антисмысловой праймер 3695/3036. Праймер 3695 содержал 5′-концевую последовательность, уникальную для unc-7 f . Продукт ПЦР клонировали в pXMX-T3 (-) в сайтах Bamh2 / Age1 с получением плазмиды unc-7f ( wp1814 ). unc-7h кДНК клонировали с помощью двух стадий ПЦР с использованием плазмиды wp776 в качестве матрицы. Смысловые / антисмысловые праймеры, использованные для первой и второй стадий, составляли 3696/3036 и 3697/3036 соответственно. Смысловые праймеры 3696 и 3697 содержали 5′-концевую последовательность, уникальную для unc-7 h . Второй продукт ПЦР клонировали в pXMX-T3 (-) в сайтах Bamh2 / Age1 с получением плазмиды unc-7h ( wp1815 ). Плазмида unc-9 ( wp778 ) была получена путем вырезания вставки кДНК unc-9 из ранее описанной плазмиды ( 37 ) и клонирования ее в pXMX-T3 (-) по сайтам Bamh2 / Age1. .Последовательности праймеров, используемых для клонирования кДНК unc-7 , перечислены в таблице S5. Плазмида unc-7a :: GFP для экспрессии ооцитов ( wp1960 ) была получена в два последовательных этапа: (i) клонированная кодирующая последовательность GFP (EGFP) из существующей плазмиды ( wp757 ) в другую плазмиду ( wp572 ) на сайтах Age1 и Nhe1, чтобы получить wp1959 , в котором кодирующая последовательность EGFP была слита в рамке считывания с 3′-концом unc-7a , и (ii) клонировать unc-7a :: egfp Вставка из wp1959 в wp776 на сайтах Bamh2 и EcoR1 (для замены вставки unc-7a ).
Экспрессия кРНКПлазмиды unc-7 и unc-9 , описанные выше, были линеаризованы с использованием рестрикционного фермента Fsp I и использованы в качестве матриц для синтеза кРНК. Кепированные кРНК синтезировали с использованием набора для транскрипции mMESSAGE mMACHINE T3 (AM1348, Thermo Fisher Scientific). Каждый раствор для инъекции кРНК представлял собой смесь конкретной кРНК (от 500 до 800 нг / мкл) и двух антисмысловых олигонуклеотидов коннексина 38 (по 100 нг / мкл каждого). Нуклеотидные последовательности двух олигонуклеотидов были 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3 ‘и 5′-AGCAGAAGAGTATACTTCTGTTTGT-3’ ( 38 ).Приблизительно 50 нл смеси вводили на ооцит с помощью инжектора Drummond Nanoject II (Drummond Scientific). Желточную мембрану ооцита удаляли с помощью пинцета Dumont # 5 (500341, Word Precision Instruments, Сарасота, Флорида) во время процесса спаривания. Спаривание ооцитов и последующие записи выполняли в чашке Петри объемом 3 мл, в которой небольшой вырезанный кусок Nunc MicroWell MiniTray (438733, Nalge Nunc International, Рочестер, Нью-Йорк) был приклеен ко дну с двумя ооцитами, помещенными в каждую лунку, а также описано другими ( 38 ).Введенные ооциты инкубировали в растворе ND96 [96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl 2 , 1 мМ MgCl 2 и 5 мМ Hepes (pH 7,5)] в течение 2–5 дней в камере для окружающей среды (15 ° C) перед сопряжением. Парные ооциты инкубировали в растворе ND96 от 12 до 24 часов при комнатной температуре (от 20 до 22 ° C) перед электрофизиологической записью.
Электрофизиология ооцитов
Записи с фиксацией напряжения выполнялись с использованием двух усилителей Oocyte Clamp (OC-725C, Warner Instruments LLC, Hamden, CT), оснащенных датчиками дифференциального напряжения (7255DI, Warner Instruments).Усилители были установлены в режим измерения тока на стороне высокого напряжения для записи I j . Электроды тока и напряжения (сопротивление от 1,5 до 1,8 МОм), а также электроды дифференциального напряжения вытягивали из капилляров из боросиликатного стекла (TW150F-4, World Precision Instruments). Наконечники электродов дифференциального напряжения были вручную сломаны до большего размера (сопротивление ~ 0,2 МОм), заполнены раствором ND96 и подключены к головным каскадам через держатели микроэлектродов (MEh2S15, World Precision Instruments).Два ооцита каждой пары поддерживали при -30 мВ, после чего к одному ооциту применяли серию ступеней напряжения (от -150 до +90 мВ), в то время как другой поддерживали постоянным при -30 мВ для записи I j . Впоследствии протокол напряжения был повторен, но два ооцита поменялись местами, чтобы быть приемником шагов напряжения и монитором I j . Интервалы между последовательными шагами В, и составляли 10 мВ, за исключением добавления шагов -5 и +5 мВ.В каждой записи положительные и отрицательные В j шагов применялись попеременно от высокого к низкому (например, +120, -120, +110, -110, ……, +10, -10, +5, -5 мВ). I j из первых двух V j шагов (+120 и -120 мВ) были исключены в последующих анализах данных. Данные были отфильтрованы при 1000 Гц и дискретизированы при 2000 Гц. Использование лягушек соответствовало руководящим принципам институционального комитета по уходу за животными и использованию и было одобрено институциональным наблюдательным советом.
unc-7b knockoutunc-7b isoform-specific knockout был достигнут с использованием подхода CRIPR-Cas9. В частности, направляющую последовательность из 19 п.н., идентичную целевой последовательности в первом экзоне unc-7b , клонировали в вектор pDD162 (P eft-3 :: Cas9 + пустая одиночная направляющая РНК, Addgene # 47549). В полученную конструкцию одновременно вводили восстанавливающий праймер (3475), в который был введен стоп-кодон. Нокаут-черви были идентифицированы с помощью ПЦР с использованием пары специфических праймеров (3476/3477) и подтверждены секвенированием.
unc-7 спасение мутантакДНК, кодирующих UNC-7b дикого типа, UNC-7a дикого типа и UNC-7a :: GFP, были экспрессированы в интернейронах AVA unc-7 (e5) с использованием двух промоторы (P flp-18 и P gpa-14 ) в подходе Cre-LoxP ( 39 ). В этих экспериментах кДНК unc-7a и unc-7b были клонированы независимо в wp1338 (pCoS10, P flp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: ChR2 :: mCherry :: SL2 :: GFP) ( 39 ) для создания двух плазмид: wp1677 (P flp-18 (3.3 кб) :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: UNC-7a) и wp1678 (P flp-18 (3,3 кб) :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: UNC-7b). wp1961 (P flp-18 (3.3 kb) :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: UNC-7a :: GFP) был создан путем клонирования вставки unc-7a :: egfp из wp1959 в wp1677 на сайтах Nhe1 и Nco1. Три плазмиды ( wp1677 , wp1678 и wp1961 ) независимо друг от друга инъецировали с wp1339 (pNP259: P gpa-14 :: Cre) в мутант unc-7 (e5) для достижения AVA. -нацеленное выражение ( 39 ).Интернейроны AVA в этих трансгенных штаммах были помечены GFP с использованием того же подхода.
Сайт-направленный мутагенез
Плазмиды для экспрессии различных мутированных изоформ UNC-7b в ооцитах Xenopus были созданы путем мутации wp1275 с использованием специфических смысловых и антисмысловых пар праймеров и PfuUltra (Agilent Technologies, Ла-Холла, Калифорния, США) в подходе на основе ПЦР (сайт-направленный мутагенез QuickChange). Область вставки кДНК unc-7b каждой вновь созданной плазмиды была полностью секвенирована, чтобы подтвердить, что только предполагаемая мутация была введена в unc-7b .
unc-7b определение паттерна экспрессииКороткий геномный фрагмент (563 п.н.), включающий часть первого экзона unc-7b и непосредственно предшествующую последовательность, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием пары праймеров 3382/3383 и слили с GFP в векторе экспрессии червя, полученном из pPD118.20. Полученную плазмиду ( wp1692 ) линеаризовали с помощью Hind III и совместно вводили в lin-15 (n765) с фосмидой WRM0613cD09, которая была линеаризована с помощью Tth III и плазмиды восстановления lin-15 .Чтобы определить, экспрессируется ли unc-7b в интернейронах AVA, трансген был скрещен с интегрированным штаммом, экспрессирующим mStrawberry в AVA ( ZW1140 ), который был создан путем коинжекции wp1392 (P flp-18 :: loxP :: LacZ :: STOP :: loxP :: mStrawberry), wp1339 и lin-15 , спасающая плазмида в lin-15 (n765) .
C. elegans электрофизиологияВсе электрофизиологические эксперименты проводились на взрослых гермафродитах.Животное обездвиживали путем нанесения тканевого адгезива Vetbond (3M Company, Сент-Пол, Миннесота) на переднюю часть спины, позволяя его хвосту свободно раскачиваться во время эксперимента. Продольный разрез был сделан вдоль области склеивания, чтобы обнажить AVA и VA5. После очистки внутренностей отсасыванием через стеклянную пипетку лоскут для кутикулы отгибали и приклеивали к покровному стеклу. Препарат препарированного червя обрабатывали коллагеназой A (0,5 мг мл -1; Roche Applied Science, каталожный номер 10103578001) в течение 10-15 с и перфузировали внеклеточным раствором до 5-10-кратного объема ванны.Моторный нейрон VA5 был идентифицирован на основе его анатомического расположения, тогда как идентификация AVA была облегчена путем экспрессии GFP в AVA с использованием двух промоторов и подхода Cre-LoxP ( 39 ). Микроэлектроды (сопротивление ∼20 МОм), вытянутые из капилляров из боросиликатного стекла (BF120-69-10, Sutter Instruments, Novato, Калифорния, США) и отполированные огнем, использовались для записи двухнейронных фиксаторов напряжения с усилителем (MultiClamp 700B, Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США) и программное обеспечение Clampex (версия 10, Molecular Devices).Классическая цельноклеточная конфигурация была получена путем приложения отрицательного давления к записывающей пипетке. I j были записаны, удерживая либо AVA, либо VA5 на уровне -30 мВ, в то время как его аналог был изменен на серию мембранных напряжений (от -110 до +50 мВ). Данные фильтровались с частотой 2 кГц и дискретизировались с частотой 10 кГц. Раствор пипетки содержал 120 мМ KCl, 20 мМ КОН, 5 мМ трис, 0,25 мМ CaCl 2 , 4 мМ MgCl 2 , 36 мМ сахарозу, 5 мМ EGTA и 4 мМ Na 2 АТФ (pH 7.2). Раствор ванны содержал 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 5 мМ CaCl2, 5 мМ MgCl2, 11 мМ декстрозу и 5 мМ Hepes (pH 7,2).
Анализ данных и построение графиков
Анализ стационарных I j GJs в ооцитах XenopusУсредненное установившееся состояние I j с последних 500 мс каждого V j шаг были количественно определены и преобразованы в G j . Впоследствии G j гомотипических и гетеротипных GJ обрабатывались несколько иначе.Для гомотипных GJ значения G j в отрицательном и положительном диапазонах V j были сначала независимо подогнаны к функции Больцмана, G j = (1- G jmin ) / {1 + exp [ A ( V j — V 0 )]} + G jmin , для экстраполяции G jmax при 0 мВ V j , а затем нормализовать на основе экстраполированного G jmax для повторного соответствия функции Больцмана.Результаты второго подбора были использованы для статистического анализа. Для гетеротипных GJ все значения G j каждой записи были нормализованы на наибольшее значение G j (номинальное значение G jmax ) либо из отрицательного, либо из положительного диапазона V j . Восходящие и нисходящие части результирующего соотношения G j -V j были независимо подогнаны к функции Больцмана с результатами подгонки, используемыми для статистического анализа.В функции Больцмана V 0 — это V j , при котором G j — половина максимального значения, G jmin — минимум G j и A — константа кооперативности. Зависимые переменные из подгонки Больцмана ( V 0 , G jmin и A ) сравнивались между положительным и отрицательным диапазоном V j парным тестом t и между различных ГД с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими тестами Тьюки с использованием OriginPro 2019 (OriginLab, Нортгемптон, Массачусетс, США) и SPSS (IBM Corp., Армонк, штат Нью-Йорк, США) соответственно.
Анализы пика I j гетеротипических GJ в ооците XenopusПик I j на каждом шаге V j были количественно определены с помощью ClampFit и нормализованы j при −110 или +110 мВ от В j , как указано в подписях к рисункам, для построения зависимости пика I j — V j .В случаях сильного выпрямления (например, все ГДж UNC-7b / UNC-9 и несколько ГДж UNC-7f / UNC-9 и UNC-7h / UNC-9) пик I j на стороне малого тока были определены количественно из той же временной точки пика I j на противоположной стороне. Результирующий пик I j — V j отношения и пик I j отношения различных гетеротипных GJ сравнивали с помощью двухстороннего смешанного ANOVA или однофакторного ANOVA, как показано на рисунке. легенды.Статистически значимые различия были обнаружены с помощью тестов Тьюки.
Анализы I j между AVA и VA5Усредненное значение I j между 100 и 200 мс каждого шага V j было количественно определено с помощью ClampFit и использовано для построения графика I j — V j отношения, которые сравнивали между разными генотипами с помощью смешанного дисперсионного анализа с использованием SPSS с напряжениями в качестве фактора внутри субъектов и генотипами в качестве фактора между субъектами.Статистически значимые различия были обнаружены с помощью тестов Тьюки. Данные представлены как средние значения ± SE. P <0,05 считается статистически значимым. Все графики были сделаны в Origin Pro.
Благодарности
Мы благодарим C. Peracchia за помощь в методике регистрации соединительных токов между ооцитами Xenopus и K. Wang и K. Wacker за полезные комментарии к рукописи. Финансирование: Это исследование было поддержано NIH R01NS109388 (Z.-W.W.), NIH R01MN085927 (для Z-W.W.) И NIH GM113004 (для BC). Вклад авторов: Ю.С. провели все эксперименты с ооцитами Xenopus , создали трансгенные и нокаутные штаммы червей и провели анализ данных. П.Л. провели все электрофизиологические эксперименты с C. elegans и провели анализ данных. H.Z. провели предварительные эксперименты. ДО Н.Э. помог с экспериментальным дизайном. Z.-W.W. руководил проектом и написал рукопись при участии соавторов. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.
ССЫЛКИ И ПРИМЕЧАНИЯ
2. Раш Дж. Э., Курти С., Вандерпул К. Г., Камасава Н., Наннапанени С., Паласиос-Прадо Н., Флорес К. Э., Ясумура Т., О’Брайен Дж., Линн Б. Д., Букаускас Ф. Ф., Надь Дж. И., Переда А. Э., Молекулярная и функциональная асимметрия электрического синапса позвоночных. Нейрон 79, 957–969 (2013). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Ауэрбах А. А., Беннет М. В., Выпрямляющий электротонический синапс в центральной нервной системе позвоночного животного. J. Gen. Physiol. 53, 211–237 (1969). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 4. Фелан П., Гулдинг Л. А., Там Дж. Л. Ю., Аллен М. Дж., Даубер Р. Дж., Дэвис Дж. А., Бэкон Дж. П., Молекулярный механизм выпрямления в идентифицированных электрических синапсах в системе гигантских волокон Drosophila .Curr. Биол. 18, 1955–1960 (2008). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Рингхэм Г. Л., Локализация и электрические характеристики гигантского синапса в спинном мозге миноги. J. Physiol. 251, 395–407 (1975). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Вадепуль М., Подавление возбуждающих мотонейронов одним нейроном в центральной нервной системе пиявки. J. Exp. Биол. 143, 509–527 (1989). [PubMed] [Google Scholar] 7. Рела Л., Щупак Л., Коактивация мотонейронов регулируется сетью, объединяющей электрические и химические синапсы.J. Neurosci. 23, 682–692 (2003). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Шрути С., Шульц Д. Дж., Летт К. М., Мардер Э., Электрическая связь и экспрессия иннексина в стоматогастральном ганглии краба Cancer borealis . J. Neurophysiol. 112, 2946–2958 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Лю П., Чен Б., Мейллер Р., Ван З.-В., Щелевые соединения, выпрямляющие антидром, усиливают химическую передачу в функционально смешанных электрохимических синапсах. Nat. Commun.8, 14818 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. Девор А., Яром Ю., Электротоническая связь в нижнем оливковом ядре, выявленная при одновременной двойной записи участков. J. Neurophysiol. 87, 3048–3058 (2002). [PubMed] [Google Scholar] 11. Гутьеррес Г. Дж., Мардер Э., Выпрямление электрических синапсов может повлиять на влияние синаптической модуляции на устойчивость выходного паттерна. J. Neurosci. 33, 13238–13248 (2013). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Эдвардс Д. Х., Йе С.Р., Красне Ф. Б., Обнаружение совпадений нейронов с помощью чувствительных к напряжению электрических синапсов. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 95, 7145–7150 (1998). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13. Мардер Э., Электрические синапсы: помимо скорости и синхронности вычислений. Curr. Биол. 8, R795 – R797 (1998). [PubMed] [Google Scholar] 14. Марш А. Дж., Мишель Дж. К., Адке А. П., Хекман Э. Л., Миллер А. С., Асимметрия внутриклеточного каркаса электрических синапсов позвоночных. Curr. Биол. 27, 3561–3567.e4 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 15. Маркс В. Д., Скерретт И. М., Роль аминоконца в стробировании напряжения и переключающем выпрямлении встряхивающих иннексинов B. J. Neurophysiol. 111, 1383–1395 (2014). [PubMed] [Google Scholar] 16. Кавано Т., По М. Д., Гао С., Люн Г., Рю В. С., Чжэнь М., Дисбаланс: щелевидные соединения снижают активность обратной двигательной цепи до смещения C. elegans для движения вперед. Нейрон 72, 572–586 (2011). [PubMed] [Google Scholar] 18.Скерретт И. М., Уильямс Дж. Б., Структурное и функциональное сравнение каналов щелевых соединений, состоящих из коннексинов и иннексинов. Dev. Neurobiol. 77, 522–547 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19. Старич Т. А., Сюй Дж., Скерретт И. М., Николсон Б. Дж., Шоу Дж. Э., Взаимодействия между иннексинами UNC-7 и UNC-9 опосредуют специфичность электрических синапсов в двигательной нервной системе Caenorhabditis elegans . Neural Dev. 4, 16 (2009). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20.Уайт Дж. Г., Саутгейт Э., Томсон Дж. Н., Бреннер С., Строение нервной системы нематоды Caenorhabditis elegans . Филос. Пер. R. Soc. Лондон. B Biol. Sci. 314, г. 1–340 (1986). [PubMed] [Google Scholar] 21. Бхаттачарья А., Агаева Ю., Бергхофф Э. Г., Хоберт О., Пластичность электрического коннектора C. elegans . Клетка 176, 1174–1189.e16 (2019). [PubMed] [Google Scholar] 22. Алтун З. Ф., Чен Б., Ван З.-В., Холл Д. Х., Карта высокого разрешения Caenorhabditis elegans белков щелевых контактов.Dev. Дин. 238, 1936–1950 (2009). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23. Старич Т. А., Герман Р. К., Шоу Дж. Э., Молекулярный и генетический анализ unc-7 , гена Caenorhabditis elegans , необходимого для скоординированного передвижения. Генетика 133, 527–541 (1993). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. де Боно М., Марик А. В., Нейрональные субстраты со сложным поведением у C. elegans . Анну. Rev. Neurosci. 28, 451–501 (2005). [PubMed] [Google Scholar] 25.Чен Б., Лю К., Ге К., Се Дж., Ван З.-В., UNC-1 регулирует щелевые соединения, важные для передвижения у C. elegans . Curr. Биол. 17, 1334–1339 (2007). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 26. Джанг Х., Леви С., Флавелл С. В., Менде Ф., Латам Р., Циммер М., Баргманн К. И., Рассечение нейронных цепей щелевых контактов, которые регулируют социальное поведение у Caenorhabditis elegans . Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 114, E1263 – E1272 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 27.Сессия AM, Уно Ю., Квон Т., Чепмен Дж. А., Тойода А., Такахаши С., Фукуи А., Хикосака А., Судзуки А., Кондо М., ван Херинген С. Дж., Куигли И., Хайнц С., Огино Х., Очи Х., Хеллстен У., Лайонс Дж. Б., Симаков О., Путнам Н., Ститес Дж., Куроки Й., Танака Т., Мичиуэ Т., Ватанабе М., Богданович О., Листер Р. , Georgiou G., Paranjpe SS, van Kruijsbergen I., Shu S., Carlson J., Kinoshita T., Ohta Y., Mawaribuchi S., Jenkins J., Grimwood J., Schmutz J., Mitros T., Mozaffari С.В., Сузуки Ю., Харамото Ю., Ямамото Т.С., Такаги К., Хилд Р., Миллер К., Хауденшильд К., Кицман Дж., Накаяма Т., Изуцу Ю., Роберт Дж., Фортриде Дж., Бернс К., Лотай В., Карими К. ., Ясуока Ю., Дихманн Д.С., Флайник М.Ф., Хьюстон Д.В., Шендур Дж., Дюпаскье Л., Визе П.Д., Цорн А.М., Ито М., Маркотт Э.М., Уоллингфорд Дж. Б., Ито Ю., Асашима М., Уэно Н. , Мацуда Й., Винстра Дж.Дж., Фудзияма А., Харланд Р.М., Тайра М., Рохсар Д.С., Эволюция генома аллотетраплоидной лягушки Xenopus laevis . Природа 538, г. 336–343 (2016).[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Маэда С., Накагава С., Шуга М., Ямасита Э., Осима А., Фудзиёси Ю., Цукихара Т., Структура канала щелевого контакта коннексина 26 при разрешении 3,5 Å. Природа 458, г. 597–602 (2009). [PubMed] [Google Scholar] 29. Осима А., Тани К., Фудзиёси Ю., Атомная структура канала щелевого контакта иннексин-6, определенная крио-ЭМ. Nat. Commun. 7, 13681 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Пурник П. Э., Бенджамин Д. К., Верселис В. К., Барджелло Т. А., Дауд Т. Л., Структура аминоконца белка щелевого соединения. Arch. Biochem. Биофиз. 381, г. 181–190 (2000). [PubMed] [Google Scholar] 31. Майерс Дж. Б., Хаддад Б. Г., О’Нил С. Э., Чорев Д. С., Йошиока К. С., Робинсон К. В., Цукерман Д. М., Райчоу С. Л., Структура нативного линзового коннексина 46/50 межклеточных каналов с помощью крио-ЭМ. Природа 564, г. 372–377 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32. О С., Ривкин С., Тан К., Верселис В. К., Барджелло Т. А., Детерминанты гейтирования полуканала коннексина 32.Биофиз. Дж. 87, 912–928 (2004). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Верселис В. К., Гинтер С. С., Барджелло Т. А., Противоположные полярности стробирования напряжения двух тесно связанных коннексинов. Природа 368, г. 348–351 (1994). [PubMed] [Google Scholar] 34. Пурник П. Э. М., О С., Абрамс К. К., Верселис В. К., Барджелло Т. А., Инверсия стробирующей полярности щелевых контактов путем замены отрицательного заряда в N-конце коннексина 32. Biophys. Дж. 79, 2403–2415 (2000). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 35.Осима А., Тани К., Толоуэ М. М., Хироаки Ю., Смок А., Инукай С., Кон А., Николсон Б. Дж., Сосинский Г. Э., Фудзиёси Ю., Асимметричные конфигурации и N-концевые перестановки в каналах щелевых контактов коннексина 26. J. Mol. Биол. 405, г. 724–735 (2011). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Муса Х., Фенн Э., Край М., Джемел Дж., Бейер Э. К., Винстра Р. Д., Аминоконцевые остатки глутамата придают чувствительность к спермину и влияют на стробирование напряжения и проводимость канала щелевых контактов коннексина 40 крысы.J. Physiol. 557, г. 863–878 (2004). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Лю К., Чен Б., Гайер Э., Джоши Дж., Ван З.-В., Щелевые соединения с низкой проводимостью обеспечивают специфическое электрическое соединение в мышечных клетках стенки тела Caenorhabditis elegans . J. Biol. Chem. 281, 7881–7889 (2006). [PubMed] [Google Scholar] 38. Пераккия К., Ван Х. Г., Пераккия Л. Л., Химическая вентиляция каналов щелевого соединения. Методы 20, 188–195 (2000). [PubMed] [Google Scholar] 39. Шмитт К., Шультейс К., Хассон С. Дж., Левальд Дж. Ф., Готшалк А., Специфическая экспрессия channelrhodopsin-2 в отдельных нейронах Caenorhabditis elegans . PLOS ONE 7, e43164 (2012). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]Дэни Дэниэлс ВК жесткое порно
Дэни Дэниелс ВК жесткое порно | Pornharbour.net10:15
3394
1414
05:06
195
104
05:01
2034
1149
08:01
765 80003
01245
127
06:13
570
301
07:59
473
198
08:01
2560
1392
000
0005 139
05:12
1157
737
09:00
553
287
04:14
1006
456
05:01
518 27102000
518 27102000
1119
545
08:02
466
183
07:30
786
445
13:15
487
274
487
274
82 92 9508:05
2120
958
06:05
4109
2118
07:50
327
159
08:00
265
000
000 17002000
000 17000000
06:59
1542
763
05:55
1897
958
06:45
4781
1625
08:00
2707
130002 130003
2707
130002 130003 2037
1072
05:00
346
141
09:57
543
256
08:01
240
125
05:50
000
000
000 07:04
387
215
07:50
1000
501
19:54
500
244
04:12
1047
501
25
1920 90 003
04:54
1399
573
07:52
1663
767
05:00
1398
683
08:00
141
93
516
215
08:54
699
318
06:58
2299
931
04:59
3007
1526
000
000
000
1526
000
000
07:42
661
298
05:40
3068
1516
05:00
423
176
08:02
585
264
585
264
264 366
182
05:50
8644
3976
22:07
1568
1222
05:00
441
243
451
243
05000 94
94 94 07:23649 9 0003
324
10:00
1393
677
08:01
1216
647
11:13
1359
688
09:00
0002 393393 : 50
1495
760
04:38
2098
904
09:57
4108
1889
09:56
1421
756
1421
756
86
10:00
270
131
09:56
3519
1703
05:50
653
293
08:00
362 165
362 165
50468
282
07:00
300
148
21:57
2356
1417
06:50
449
308
000
2111
08: 0 3
701
308
08:00
1911
1087
05:55
334
173
05:01
452
267
000
0003
0003
0003
0003
0003 210
06:12
174
121
09:00
1192
572
06:00
412
219
04:08
257 1000003
000
2040
889
05:41
692
344
06:50
321
216
05:00
1425
1203666
0006
29:29
2837
1029
07:30
665
364
09:59
388
209
08:01
2301 12382000
1504
732
10:00
653
300
08:20
1083
424
06:02
206
104
06:55
3955
0002 18841486
751
10:00
272
119
05:00
265
138
26:59
4158
1633
123220001633
000
000
05:50
5477
2251
08:00
1264
568
06:03
4063
1450
10:02
189
53
105:10
189
53
105:10 470
320
05:00
14489
7562
05:10
392
201
06:03
2028
698
0005:40 9352000
000
000
000 07:50
900 02 1480672
06:05
422
218
09:58
1556
964
06:17
1431
708
08:02
708
08:0211:13
721
292
08:05
8683
3286
09:55
1410
627
08:00
842
00 391 Ava Max Пустой особняк под дождем недалеко от побережья
Сейчас та атмосфера, которую я чувствую в своей душе
Как паук, это паутина, которую вы сплели
Теперь есть сердце, где раньше был призракИ ох, да, это меня беспокоит
Теперь я слышу звуки в коридоре
Кресла-качалки двигаются сами по себе
Я влюбляюсь в тебя
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня беситВ лесу тишина после снегопада
Это сейчас атмосфера, часть моей души
Как паук, это паутина, которую вы сплели
Теперь есть сердце, где раньше был призракИ ох, да это меня беспокоит
Теперь я слышу звуки в коридоре
Кресла-качалки двигаются сами по себе
Я влюбляюсь в тебя
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня бесит
Звуки в коридоре
Кресла-качалки двигаются сами по себе
Я влюбляюсь в тебя
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня беситDo, doo, do, doo, do, doo, do, doo, do, doo, do, doo, doo, do
Делай, делай, ду, делай
Do, doo, do, doo, do, doo, do, doo, do, doo, do, doo, doo, do
Делай, делай, ду, делай
Страшно но красивоЗвуки в коридоре
.
Кресла-качалки двигаются сами по себе
Я влюбляюсь в тебя
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня бесит
Звуки в коридоре
Кресла-качалки двигаются сами по себе
Я влюбляюсь в тебя
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что это меня бесит
Настолько, что меня бесит